设施栽培土壤氧化亚氮（N_2O）释放和甲烷（CH_4）氧化及其微生物学机理的研究

【摘要】： 甲烷和氧化亚氮是重要的温室效应气体，它们对温室效应的贡献仅决于CO_2，居第二、三位。目前国内外关于农田甲烷和氧化亚氮排放通量的研究，仅局限于报道大田作物在当季生长期内甲烷和氧化亚氮的排放及其影响因子，但在设施栽培条件下土壤甲烷和氧化亚氮排放及其微生物学机理及相互间关系至今未见报道。因此，研究农业设施栽培条件下，甲烷和氧化亚氮排放及其微生物学机理，既可明确甲烷和氧化亚氮的排放通量，又能提供有效控制甲烷和氧化亚氮排放的措施，为农业和环境的可持续发展提供科学依据。 本文研究了蔬菜设施栽培土壤氧化亚氮释放和甲烷氧化及其微生物学机制。试验结果分述如下： 1) 设施蔬菜栽培土壤中氧化亚氮释放通量高于露地蔬菜栽培土壤；灌水对土壤氧化亚氮释放有明显促进作用；尿素能促进氧化亚氮的排放且施用量越多促进作用越明显；施有机肥(酵素菌肥)的土壤中氧化亚氮的释放量高于施尿素的土壤；长效尿素对氧化亚氮释放的促进作用最微弱；38℃下氧化亚氮的释放高于15℃；pH为7.3时，土壤释放氧化亚氮的能力最强；不同碳源实验证实，葡萄糖对氧化亚氮释放的促进作用最强。对硝化细菌和反硝化细菌数量的检测观察到，在不同的条件下，两种细菌对氧化亚氮的释放贡献不一样。研究也表明在自然界中除了硝化(包括自养和异养型)细菌和反硝化细菌种群以外，甲烷氧化菌可能也是对氧化亚氮释放具有一定贡献的细菌类群。 2) 对设施蔬菜栽培土壤甲烷氧化的研究结果表明，不同土壤对甲烷的氧化能力各异，这可能与土壤的理化性质有关。土壤微生物是甲烷氧化的主要生物类群，含水量对土壤甲烷氧化活性有明显影响，过高或过低对甲烷氧化均具有抑制作用；氮源(包括有机和无机氮源)对甲烷氧化均有抑制作用；不同碳源对甲烷氧化的影响各异，纤维素对甲烷氧化抑制作用最小，而高浓度的甲醇、葡萄糖则对甲烷氧化具有强烈抑制作用；而适当浓度的甲醇可极大促进土壤对甲烷的氧化：在甲烷氧化过程中加入葡萄糖能迅速抑制甲烷氧化；在加入葡萄糖的同时保持瓶中充足的氧气，则这种抑制作用可以在重新培养一定时间后得到解除。此外，还研究了从土壤中分离的甲烷氧化菌对碳源的利用情况，表明在甲烷释放极少的设施栽培土壤中，兼性营养的甲烷氧化菌可能在甲烷氧化中占据主导地位。 一 3）从土壤中分离到一株异养型硝化细菌，命名为菌株HN，分离菌株为革兰氏染色阳 性，球状或杆状。菌落颜色为橙红色。该菌株能以乙酞胺为唯一碳源和氮源进行氨 化作用和硝化作用并产生亚硝酸。以硝酸钠为氮源时能进行反硝化作用。部分长度 的 16s rRNA序列分析表明，分离菌株 HN与 Rhodococc。ruber具有 99％相似性。 并用PHYLIPS程序将该菌株与报道的相关硝化细菌进行系统发育进化分析。 【关键词】：设施蔬菜栽培 氧化亚氮形成 甲烷氧化 影响因子 微生物学机制
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2002
【分类号】：S153;S154.3
【目录】：

• 中文摘要8-10
• 英文摘要10-12
• Ⅰ． 前言12-25
• 1． 氧化亚氮和甲烷的源与汇12-13
• 2． 温室效应气体氧化亚氮形成的微生物学分子机理13-18
• 2．1 氧化亚氮形成的生物化学13-15
• 2．2 反硝化作用的分子生物学15-17
• 2．2．1 编码Nar的基因15
• 2．2．2 编码Nir的基因15-16
• 2．2．3 编码Nor的基因16
• 2．2．4 编码Nos的基因16-17
• 2．3 硝化作用的分子生物学17-18
• 2．3．1 编码AMO的基因17
• 2．3．2 编码HAO的基因17-18
• 2．3．3 编码NOR的基因18
• 3． 甲烷氧化菌的甲烷单加氧酶和分子生态学18-25
• 3．1 甲烷单加氧酶（MMO）19-21
• 3．1．1 SMMO19-20
• 3．1．2 pMMO20-21
• 3．2 甲烷氧化菌的分子生态学21-25
• 3．2．1 功能基因探针21
• 3．2．2 针对16S rRNA的系统发育基因探针21-23
• 3．2．3 荧光原位杂交（Fluorescent in situ hybridisation，FISH）23
• 3．2．4 变性梯度凝胶电泳（Denaturing gradient gel eletrophoresis）23-25
• Ⅱ． 材料与方法25-33
• 1． 设施栽培土壤氧化亚氮释放的研究25-28
• 1．1 试验地点25
• 1．2 试验项目25-26
• 1．2．1 设施栽培土壤和露地土壤氧化亚氮的释放量25
• 1．2．2 灌水试验25
• 1．2．3 不同施氨水平试验25-26
• 1．2．4 不同肥料类型试验26
• 1．2．5 不同氮肥形态试验26
• 1．2．6 温度对氧化亚氮释放的影响26
• 1．2．7 不同pH试验26
• 1．2．8 不同碳源物质试验26
• 1．3 氧化亚氮的采集与测定26-27
• 1．4 硝化细菌的计数27-28
• 2． 设施栽培土壤甲烷氧化的研究28-30
• 2．1 供试土壤28
• 2．2 试验项目28-29
• 2．2．2 土壤微生物对土壤甲烷氧化的贡献研究28
• 2．2．3 不同含水量土壤的甲烷氧化活性28
• 2．2．4 不同氮源对土壤氧化甲烷的影响28
• 2．2．5 不同碳源对土壤氧化甲烷的影响28-29
• 2．2．6 葡萄糖与通气对土壤氧化甲烷的影响29
• 2．3 甲烷测定29
• 2．4 甲烷氧化菌的分离29-30
• 2．4．1 甲烷氧化菌培养基（NMS）29
• 2．4．2 富集29-30
• 2．4．3 分离纯化30
• 2．4．4 碳源试验（纯培养）30
• 3． 异养型硝化细菌特性研究30-33
• 3．1 异养型硝化细菌的分离30
• 3．1．1 培养基组成30
• 3．1．2 富集分离30
• 3．2 碳源和氮源试验30
• 3．3 氨化和硝化作用试验30
• 3．4 分离菌株反硝化活性30-31
• 3．5 异养型亚硝化细菌的鉴定及系统发育分析31-33
• 3．5．1 显微摄影31
• 3．5．2 16S rDNA的PCR扩增和测序31
• 3．5．3 系统发育分析31-33
• Ⅲ． 结果与讨论33-50
• 3．1 设施栽培土壤氧化亚氮释放及其微生物机理的研究33-38
• 3．1．1 设施栽培和露地栽培中氧化亚氮的释放通量33
• 3．1．2 灌水对氧化亚氮释放量和相关菌群的影响33-34
• 3．1．3 不同施氮水平对氧化亚氮释放通量和相关菌群的影响34-35
• 3．1．4 不同肥料种类对氧化亚氮释放量和相关菌群的影响35-36
• 3．1．5 不同氮肥形态对氧化亚氮释放量和相关菌群的影响36-37
• 3．1．6 温度对土壤氧化亚氮释放的影响37-38
• 3．1．7 pH和碳源对氧化亚氮释放的影响38
• 3．2 设施栽培土壤甲烷氧化的研究38-44
• 3．2．1 不同大棚土壤的甲烷氧化活性38-39
• 3．2．2 土壤微生物对甲烷氧化的作用39
• 3．2．3 土壤不同含水量对甲烷氧化的影响39-40
• 3．2．4 不同氮源物质对土壤甲烷氧化活性的影响40-41
• 3．2．5 不同碳源物质对土壤甲烷氧化活性的影响41
• 3．2．6 不同甲醇浓度对甲烷氧化的影响41-42
• 3．2．7 葡萄糖对土壤氧化甲烷的影响42-43
• 3．2．8 葡萄糖的通气实验43
• 3．2．9 甲烷氧化菌分离物对不同碳源的利用43-44
• 3．3 异养型硝化细菌特性的研究44-50
• 3．3．1 不同碳源对分离菌株生长和产亚硝酸的影响44-45
• 3．3．2 不同氮源对菌株HN生长和产亚硝酸的影响45
• 3．3．4 菌株HN的氨化作用和硝化作用45
• 3．3．5 菌株HN的反硝化作用45-47
• 3．3．5 菌株HN 16S rRNA序列的测定47-49
• 3．3．6 Rhodococcus sp．菌株HN的系统发育分析49-50
• Ⅴ． 参考文献50-55

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