秸秆腐熟菌剂的细菌种群分析及其腐熟过程的动态研究

【摘要】： 本论文以秸秆腐熟菌剂为研究对象，分别采用分子生物学方法和传统平板分离方法对其细菌菌群及在腐熟过程中的变化进行分析。采用构建16S rDNA克隆文库的方法比传统平板分离方法能够更加客观、准确的反应腐熟剂样品中细菌组成，PCR—DGGE技术是目前研究接种微生物在腐熟过程中动态变化的理想方法之一。本论文研究可为秸秆腐熟菌剂的菌种合理组成、菌剂生产与应用提供依据。论文的主要结果如下。 采用构建16S rDNA克隆文库的方法研究了目前广泛应用的样品A和B的细菌组成，结果表明样品A主要是融合乳杆菌(WeisseUa confusa)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)；而样品B主要是布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)、香肠乳杆菌(Lactobacillus farciminis)和耐酸乳杆菌(Lactobacillus acetotolerans)。对比平板分离法，采用构建16S rDNA文库的方法得到的结果更全面，也更好反映出样品中的细菌组成。 DGGE分析样品田间应用取样结果表明，堆沤和凼沤这两种发酵方式的优势微生物存在较大的差异。但是都是堆沤方式的两个样品的DGGE图谱则非常相似。目的条带测序结果与产品建库测定结果相比较，测序结果均非所加秸秆腐熟剂B样品的优势细菌。 将样品A和B接种水稻秸秆小型堆肥中，采用DGGE的方法和平板培养的方法分析堆肥中的微生物动态变化，并测定堆腐过程中的温度、pH值、含水量、C／N、种子发芽率等参数。实验结果表明，添加秸秆腐熟剂可以促进堆肥顺利进行；堆肥中微生物发生明显演替，首先是乳酸菌和常温细菌大量繁殖，促进堆温升高，进入高温期后高温放线菌和高温细菌快速繁殖，在腐熟后期堆温下降后，常温菌又重新繁殖。采用DGGE图谱分析其过程中优势微生物，结果表明堆腐过程中不同时期是不同优势菌种扮演重要角色以促进秸秆顺利腐熟。并且目的条带测序结果表明，堆肥中优势菌种大多为目前不可培养微生物，并非添加样品中所含优势微生物。 本研究表明：16S rDNA克隆文库法和DGGE法可以用于微生物菌剂中的细菌组成分析，快速准确检测菌剂质量，这对于微生物菌剂质量的提高，推进微生物肥料行业的可持续发展具有重大意义；堆肥过程是由多个不同菌群主导的接力过程，腐熟剂对初期的腐熟温度的提高起到关键作用，随着腐熟进程的深入，微生物菌群发生了更替。 Bead-beader的方法适合大批量DNA的提取。DGGE的方法分析复杂微生物样品需要通过垂直电泳先确定变性剂浓度的大致范围。 【关键词】：秸秆腐熟剂 16S rDNA克隆文库 DGGE 细菌组成
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：S141.4
【目录】：

• 摘要6-7
• Abstract7-12
• 第一章 绪论12-24
• 1.1 秸秆及其应用现状12-14
• 1.2 秸秆还田与堆肥化处理14-17
• 1.2.1 秸秆堆肥化处理14-15
• 1.2.2 堆肥重要影响因素15-17
• 1.3 秸秆腐熟菌剂研究进展17-19
• 1.4 堆肥中的微生物生态学过程19-20
• 1.5 分子生态学在微生物多样性研究中的应用现状20-22
• 1.5.1 PCR扩增与多态分析及核苷酸序列分析20
• 1.5.2 DGGE20-22
• 1.6 本论文研究的意义和日的22
• 1.7 本论文研究的内容、方法和技术路线22-24
• 1.7.1 本论文研究内容和方法22-23
• 1.7.2 本论文研究所采用的技术路线23-24
• 第二章 16S rDNA克隆文库法分析秸秆腐熟菌剂细菌组成24-43
• 2.1 实验材料24-28
• 2.1.1 秸秆腐熟菌剂24
• 2.1.2 主要仪器设备24
• 2.1.3 本研究所用的其它菌株、质粒和引物24-25
• 2.1.4 培养基25-27
• 2.1.5 缓冲液和试剂27
• 2.1.6 DNA提取试剂27-28
• 2.2 实验方法28-32
• 2.2.1 总DNA的提取28-29
• 2.2.2 DNA浓度与纯度的测定29
• 2.2.3 16S rDNA的PCR扩增及PCR产物纯化29-30
• 2.2.4 PCR产物的连接30
• 2.2.5 转化30
• 2.2.6 阳性克隆的筛选30-31
• 2.2.7 ARDRA分型31
• 2.2.8 构建克隆文库31-32
• 2.3 结果与分析32-42
• 2.3.1 样品总DNA提取结果32-33
• 2.3.2 16S rDNA的PCR扩增结果及Reconditioning PCR扩增结果33-34
• 2.3.3 阳性克隆的筛选与检测34
• 2.3.4 ARDRA分型结果34-36
• 2.3.5 构建克隆文库结果36-38
• 2.3.6 两个样品组成菌株的系统发育树状图38-41
• 2.3.7 采用菌落平板计数法测定的样品结果41-42
• 2.4 本章小结42-43
• 第三章 腐熟过程的细菌动态变化研究43-50
• 3.1 实验材料43
• 3.1.1 取样43
• 3.1.2 主要仪器及试剂43
• 3.2 实验方法43-46
• 3.2.1 DNA的提取方法43-44
• 3.2.2 16S rDNA的V3区PCR扩增及PCR产物纯化44
• 3.2.3 Reconditioning PCR44-45
• 3.2.4 DGGE电泳45-46
• 3.3 结果与分析46-49
• 3.3.1 DNA提取结果46
• 3.3.2 16S rDNA的V3区PCR扩增46-47
• 3.3.3 Reconditioning PCR结果47
• 3.3.4 垂直电泳变性剂浓度的确定47-48
• 3.3.5 三个样品的DGGE分析结果和主要目的条带的测序48-49
• 3.4 本章小结49-50
• 第四章 水稻秸秆的小型堆肥试验50-65
• 4.1 实验材料50
• 4.1.1 水稻秸秆和秸秆腐熟菌剂50
• 4.1.2 主要仪器和试剂50
• 4.2 实验方法50-53
• 4.2.1 堆肥实验处理50-51
• 4.2.2 堆腐过程测定的参数及其测定方法51-52
• 4.2.3 平板计数法分析堆肥微生物52
• 4.2.4 堆肥样品DNA提取52-53
• 4.2.5 堆肥样品DGGE图谱53
• 4.3 结果与分析53-63
• 4.3.1 原料的基本理化特性53
• 4.3.2 堆肥外观效果53-54
• 4.3.3 堆肥各参数变化54-56
• 4.3.4 平板培养法测定堆肥微生物的结果56-60
• 4.3.5 DGGE分析结果60-63
• 4.4 本章小结63-65
• 第五章 结论与讨论65-67
• 5.1 结论65-66
• 5.2 讨论与展望66-67
• 参考文献67-71
• 致谢71-72
• 作者简历72

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