转Bt基因克螟稻秸秆还土对水田厌氧微生物、生物学活性及其种群多样性的研究

【摘要】：转基因作物的生态安全性一直是人们关心的热点问题之一。本论文研究了转Bt基因克螟稻秸杆还土对水田厌氧微生物、土壤酶活性、产甲烷活性、土壤细菌种群多样性及土壤产甲烷细菌多样性的影响，并且对四种土壤DNA提取方法进行了比较，研究结果总结如下： 1、克螟稻秸杆还土对土壤厌氧微生物的影响 采用亨盖特厌氧技术及其滚管法研究了转基因克螟稻秸杆还土对土壤厌氧微生物数量的影响，包括反硝化细菌、厌氧发酵细菌、厌氧自生固氮细菌、产甲烷细菌。实验结果表明，在培养期间秸秆处理的土样(NBt和NCk)组中各种厌氧微生物的数量均显著高于无秸杆对照组(No)(p＜0.05)。而转Bt基因克螟稻秸杆处理组(NBt)的反硝化细菌数量、产甲烷细菌数量要显著低于亲本稻秸杆处理(NCk)组(p＜0.05)。但是，前者的厌氧发酵细菌数量、自生固氮细菌数量要显著高于NCk处理(p＜0.05)。 2、克螟稻秸杆还土对土壤酶活性的影响 研究了克螟稻秸杆还土对各种土壤酶活性的影响，结果表明，在培养期间秸秆处理的土样(NBt和NCk)组中各土壤酶活性均显著高于无秸杆对照组(No)(p＜0.05)。NBt处理土壤的磷酸酶、纤维素酶活性与NCk处理相比只在培养前期有显著差异(p＞0.05)，而脱氢酶及其产甲烷活性则出现了显著的差异。在培养的前56d，NBt处理的脱氢酶活性要显著低于NCk处理(p＜0.05)，而在56d至84d期间，其脱氢酶活性突然显著升高，明显高于NCk处理(p＜0.05)。在培养的前44d期间，NBt处理土样的产甲烷活性显著低于NCk处理(p＜0.05)，而56d至84d期间，则显著高于NCk处理(p＜0.05)。 3、克螟稻秸杆还土对土壤细菌种群多样性的影响 采取聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)的方法研究了转基因克螟稻秸杆还土对土壤细菌种群多样性的影响。通过细菌通用引物扩增了土壤细菌的16S rDNA片段并进行DGGE电泳，计算各个样品的Shannon丰富度指数和Pielous均匀度指数，以此分析各处理样品的细菌种群多样性差异。结果表明，在培养的第3、4周时NBt处理土壤样品的 Sharinon指数均明显高NCk处理的Shannon指数，而其它培养时间内二者没有表现出差异， 说明经过克螟稻秸杆处理土壤的细菌多样性在短期内要高于亲本对照处理。Pielous均匀度 指数在第2周和第6周要明显低于亲本稻秸杆处理。 4、克螟稻秸杆还土对土壤产甲烷细菌种群多样性的影响 为了解转基因克螟稻对淹水土壤中产甲烷细菌多样性的影响，采用产甲烷细菌特异性引 物扩增产甲烷细菌165:DNA片段并结合PCR一DGGE方法，计算各个样品的Shalmon指数 和simpson指数，以此分析转基因水稻秸杆还土对水田产甲烷细菌种群多样性的影响。试验 结果表明，在培养的第7d一28d期间，NBt处理的上述两个多样性指数均明显低于NCk处理， 而第42d一84d期间，则要明显高于NCk处理。 5、四种土壤DNA提取方法的比较 采用4种土壤DNA提取方法提取了5种类型土壤的微生物总DNA，并对4种提取方 法的DNA提取效果进行综合分析，进一步通过聚合酶链式反应一变性梯度凝胶电泳法 (PCR一DGGE)扩增提取DNA中的细菌1 65:DNA片段，并对扩增产物进行DGGE电泳分 析。实验结果表明，SDS一高盐缓冲液法所提取的DNA得率最高，SDS一酚氯仿抽提法的DNA 得率最低。DNA纯度方面，以BIO一1 01 DNA extraction Kit试剂盒法最高，改进试剂盒法纯 度最低。通过PCR.DGGE所反映的土壤微生物多样性分析结果表明，BIO一1 01 DNA extraction Kit试剂盒法提取的DNA所代表的微生物多样性最全，而505酚氯仿法抽提的DNA代表 性最差。 【关键词】：克螟稻 厌氧微生物 PCR-OGGE 土壤DNA提取方法
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2004
【分类号】：S154
【目录】：

• 摘要7-9
• Abstract9-11
• 第一章 引言11-22
• 1 转基因作物的广泛种植11-12
• 2 转基因作物的风险性12-14
• 2.1 基因作物本身成为杂草12
• 2.2 转基因作物对农业生态系统中的生物多样性的影响12
• 2.3 转基因作物与靶生物抗性的进化12-13
• 2.3.1 杂草的抗性12-13
• 2.3.2 害虫的抗毒性13
• 2.4 转基因作物的遗传污染13
• 2.4.1 转基因作物使其亲缘野生种成为杂草或超级杂草13
• 2.4.2 转基因作物可能产生新的病毒13
• 2.4.3 抗生素基因的扩散13
• 2.5 转基因作物对非目标生物的危险13-14
• 3 转基因植物对土壤生态系统影响的研究进展14-17
• 3.1 外源基因及其产物在土壤中的存留研究14-15
• 3.2 转基因表达蛋白对土壤微生物的影响15
• 3.3 基因漂移15-16
• 3.4 对土壤微生物的种群组成及其数量的影响16-17
• 3.5 对土壤酶活性的影响17
• 4 检测转基因植物对土壤微生物影响方法的评估17-20
• 4.1 传统的培养方法17
• 4.2 微生物生物量和流量17-18
• 4.3 微生物生物标记物法18
• 4.4 单个细胞水平上的分析18-19
• 4.5 DNA熔解(解链)及复性分析19
• 4.6 微生物分子生物学技术19-20
• 4.7 转基因植物对土壤微生物影响评估的重要性20
• 5 转Bt基因克螟稻的培育和种植20-21
• 6 转Bt基因克螟稻的广泛种植带来的一系列担忧21-22
• 第二章 转基因克螟稻秸秆还土对水田厌氧微生物及其生物学活性的影响22-29
• 1 材料与方法22-24
• 1.1 供试土壤22
• 1.2 供试秸秆及其处理22-23
• 1.3 主要仪器23
• 1.4 试验设置23-24
• 1.4.1 微生物活性的测定23
• 1.4.2 土壤酶活性的测定23-24
• 2 结果与分析24-28
• 2.1 克螟稻秸秆还土对厌氧微生物种群和数量的影响24-26
• 2.1.1 转基因水稻秸秆对土壤反硝化细菌数量的影响24-25
• 2.1.2 转基因水稻秸杆对土壤厌氧固氮菌种群的影响25-26
• 2.1.3 转基因水稻秸杆对土壤产甲烷细菌种群数量的影响26
• 2.2 转基因克螟稻秸杆对土壤酶活性的影响26-28
• 2.2.1 转基因水稻对土壤脱氢酶活性的影响26-27
• 2.2.2 转基因克螟稻对稻田土壤磷酸酶的影响27
• 2.2.3 转基因水稻秸杆对水稻田土壤纤维素酶活性的影响27-28
• 3 小结28-29
• 第三章 土壤DNA的提取方法比较29-38
• 1 材料与方法29-31
• 1.1 供试土壤29
• 1.2 土壤DNA的提取方法29-30
• 1.2.1 改进试剂盒法(方法1)29-30
• 1.2.2 SDS-酚氯仿抽提法(方法2)30
• 1.2.3 SDS-高盐缓冲液抽提法(方法3)30
• 1.2.4 试剂盒法(方法4)30
• 1.3 DNA的定量和纯度检测30
• 1.4 PCR扩增反应条件30-31
• 1.5 DGGE分析31
• 1.6 银染法染色31
• 2 结果与讨论31-36
• 2.1 所提取的土壤DNA产率、纯度和断裂情况31-33
• 2.3 PCR扩增结果33
• 2.4 DGGE电泳图谱33-36
• 3 讨论36-38
• 第四章 采用分子生态学方法研究克螟稻秸秆还土对水田土壤细菌种群多样性的影响38-47
• 1 材料与方法38
• 1.1 试验材料38
• 1.2 试验仪器38
• 2 试验方法38-39
• 2.1 土壤DNA的提取38
• 2.2 PCR扩增38
• 2.3 DGGE分析38-39
• 2.4 银染法染色39
• 3 结果与讨论39-47
• 第五章 转Bt基因克螟稻秸秆还土对土壤中产甲烷细菌的影响47-56
• 1 材料与方法47-48
• 1.1 土壤47
• 1.2 供试秸秆及其处理47
• 1.3 产甲烷活性的测定47
• 1.4 土壤DNA的提取47
• 1.5 PCR扩增反应条件47
• 1.6 DGGE分析47-48
• 1.7 银染法染色48
• 2 结果与讨论48-56
• 3 讨论56
• 小结56-58
• 参考文献58-62
• 致谢62

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