水稻秸秆腐解复合菌系的筛选构建

【摘要】： 本论文针对我国南方油菜与水稻一年两熟的耕作制度下温度低、稻秆腐解慢、影响耕作等问题,突破传统的单一菌种纯培养筛选构建模式,采用外淘汰技术与温度梯度诱导相结合的方法,从四川成都平原多年还田的土样中,筛选构建出一组能在中温条件(22℃)下高效腐解水稻秸秆的微生物复合菌系,并对选育的复合菌系的腐解特性、菌种组成及稳定性等多方面进行分析研究。最后,对其进行了小型实验室腐解效果试验。所有这些结果为新型秸秆腐解菌剂的选育及应用提供新的思路,以推动我国南方农作区水稻-油菜农作区的秸秆还田。主要研究结果如下: 本文以成都平原多年原位还田的土样为菌种来源,通过限制性培养和逐步降低温度的诱导驯化,选用失重率、酶活等能够直接表征秸秆腐解程度的参数为筛选指标,经继代培养15代筛选得到一组能在中温条件下高效腐解水稻秸秆的复合菌系RSS-4。该复合菌系在22℃培养条件下对水稻秸秆腐解试验效果表明:pH先升高后降低,最后稳定在7.20;纤维素酶活、滤纸酶活及半纤维素酶活均经历了先升后降的变化趋势,最高酶活分别为0.91 U、0.23 U、3.40 U;到16 d腐解结束时,RSS-4对稻秆、纤维素及半纤维素的降解率分别达到了45.0%、55.5 %和44.1 %;同时发现采用未灭菌的筛选方法筛得的复合菌系RSS-4比灭菌所得的RSS-4′腐解效果要好。 采用平板分离结合16S rDNA克隆文库相结合的方法分析了复合菌系RSS-4的组成多样性,结果显示:复合菌系RSS-4的16S rDNA建库结果得出25个OUT,主要是由Uncultured bacterium、Uncultured compost bacterium、Rhodanobacter sp.、Klebsiella pneumoniae、Pseudomonas sp.、Uncultured soil bacterium、Aeromonas sp.和Uncultured gamma proteobacterium组成。相对而言,通过菌落平板计数法仅从复合菌系RSS-4中分离出来4株细菌和4株真菌。 通过DGGE结合克隆测序对稻秆腐解过程中微生物区系的动态变化进行了研究。结果显示:至少有12种细菌和18种真菌的近缘种参与到稻秆的腐解。在稻秆腐解过程中,不同腐解时期真菌的组成呈现出多样性,变化差异也较为明显。有优势菌株,它们贯穿于稻秆腐解的整个过程;些菌株在腐解的前期起作用,而后迅速消失;有些菌株在腐解的后期才出现而起作用;而有些菌株仅仅出现在腐解的某一时期。腐解过程中不同时期由不同优势菌株扮演重要角色共同促进了稻秆的腐解 稳定性试验表明:多代继代培养过程中各代复合菌系腐解产物的pH值变化趋势基本一致;多代继代培养过程中酶活动态变化趋势基本一致,其对稻秆腐解能力的差异也很小,表明复合菌系在产酶和稻秆腐解能力方面已非常稳定;用DGGE法比较来源不同传代次数的复合菌系的菌种组成变化情况,结果表明:第15～23代复合菌系之间的菌种组成没有发生明显变化。 在小型腐解试验过程中对腐解效果和腐解过程中的微生物区系变化进行了分析,结果表明:施用RSS-4菌剂的处理与对照相比,其对稻秆的腐解率要高出9.6%,腐解效果明显;处理组比对照组含有的DGGE条带更多、菌种交替较明显。 【关键词】：秸秆腐解 复合菌系 克隆文库 DGGE 菌种组成
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：S141.4
【目录】：

• 摘要6-7
• Abstract7-13
• 第一章 绪论13-30
• 1.1 秸秆资源及其组成13-20
• 1.1.1 纤维素的组成及其降解机理14-18
• 1.1.2 半纤维素的组成及其生物降解18-19
• 1.1.3 木质素的组成及其生物降解19-20
• 1.2 秸秆的利用现状20-22
• 1.2.1 直接用于还田20-21
• 1.2.2 间接用于还田21
• 1.2.3 用于生产饲料21
• 1.2.4 作为生物质能源21
• 1.2.5 在其他工业中的应用21-22
• 1.3 秸秆还田效应的研究进展22-24
• 1.3.1 秸秆还田对土壤理化性质的影响22-23
• 1.3.2 秸秆还田的生物效应23-24
• 1.4 秸秆腐熟菌剂的研究进展24-25
• 1.5 微生物分子生态学的研究进展25-28
• 1.5.1 环境基因组DNA 提取方法25-26
• 1.5.2 DNA 扩增片段梯度电泳检测技术26-27
• 1.5.3 宏基因组文库的构建和应用27
• 1.5.4 方法的组合应用27-28
• 1.6 研究的目的与意义28
• 1.7 研究内容、方法和技术路线28-30
• 1.7.1 本论文的主要研究内容和方法28-29
• 1.7.2 本论文的技术路线29-30
• 第二章 高效稳定水稻秸秆腐解复合菌系的选育30-39
• 2.1 材料与方法30-33
• 2.1.1 土壤样品的采集30
• 2.1.2 主要仪器设备30-31
• 2.1.3 培养条件31
• 2.1.4 培养基31-32
• 2.1.5 复合菌系的选育方法32
• 2.1.6 复合菌系对稻秆的分解特性测定32-33
• 2.1.7 复合菌系的安全性评价33
• 2.2 结果与分析33-38
• 2.2.1 复合菌系的选育33-34
• 2.2.2 复合菌系对稻秆的腐解特性34-38
• 2.2.3 复合菌系的安全性评价38
• 2.3 本章小结38-39
• 第三章 复合菌系RSS-4 的菌种组成多样性及腐解过程中的区系动态变化39-60
• 3.1 实验材料39-41
• 3.1.1 复合菌系RSS-439
• 3.1.2 主要仪器设备39-40
• 3.1.3 本研究所用到的其他菌株、质粒和引物40
• 3.1.4 培养基40-41
• 3.1.5 本研究所用到的缓冲液和试剂41
• 3.2 实验方法41-45
• 3.2.1 复合菌系中单菌株的分离与鉴定41-42
• 3.2.2 克隆文库法分析复合菌系RSS-4 的菌种组成多样性42-44
• 3.2.3 复合菌系RSS-4 的菌种组成多样性及腐解过程中的动态变化44-45
• 3.3 结果与分析45-58
• 3.3.1 复合菌系的菌种组成45-53
• 3.3.2 DGGE 技术研究秸秆腐解过程中菌种的动态变化53-58
• 3.4 本章小结58-60
• 3.4.1 结论58-59
• 3.4.2 讨论59-60
• 第四章 复合菌系RSS-4 的稳定性60-68
• 4.1 材料与方法60-61
• 4.1.1 培养条件60
• 4.1.2 复合菌系的性质（pH）稳定性60
• 4.1.3 复合系的功能稳定性60-61
• 4.1.4 复合菌系的组成稳定性61
• 4.1.5 测定方法61
• 4.2 结果与分析61-66
• 4.2.1 复合菌系的性质（pH）稳定性61-62
• 4.2.2 复合菌系的功能稳定性62-64
• 4.2.3 复合菌系的菌种组成稳定性64-66
• 4.3 本章小结66-68
• 第五章 复合菌系RSS-4 的小型腐解效果实验68-75
• 5.1 实验材料68-69
• 5.1.1 供试水稻秸秆和复合菌系RSS-468
• 5.1.2 主要仪器与试剂68-69
• 5.2 实验方法69
• 5.2.1 实验设计69
• 5.2.2 复合菌系对稻秆降解率的测定方法69
• 5.2.3 样品DNA 的提取69
• 5.2.4 样品DGGE 图谱69
• 5.3 结果与分析69-74
• 5.3.1 复合菌系对稻秆的腐解率69-70
• 5.3.2 基因组DNA 的提取结果70-71
• 5.3.3 腐解试验过程中细菌菌种的区系动态变化71-73
• 5.3.4 腐解试验过程中真菌菌种的区系动态变化73-74
• 5.4 本章小结74-75
• 第六章 结论与讨论75-77
• 6.1 全文结论75-76
• 6.2 讨论与展望76-77
• 参考文献77-82
• 致谢82-83
• 附录 I83-85
• 作者简历85

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