烃类化合物厌氧降解产甲烷中间代谢产物初探

【摘要】：本研究以中温（35℃）条件下烃厌氧降解富集物为材料，通过稳定性同位素标记正十六烷烃，GC-MS分析了产甲烷条件下正十六烷烃降解的中间代谢产物，揭示了厌氧降解中间代谢产物特征和代谢机制。通过分析高温（55℃）不同传代过程中正十六烷烃降解富集物的群落结构，提高了对具有高温厌氧烃功能的细菌类群认识水平。原煤作为另外一种重要化石能源，通过底物刺激、生物强化的方法，模拟厌氧微生物对不同成熟度煤样的厌氧降解产气潜力，并采用高通量手段研究原位煤藏微生物的种类及多样性，共同推进对厌氧微生物对烃降解代谢认识水平。 研究结果如下：（1）通过GC-MS对降解的中间代谢产物进行分析，找到产甲烷条件下正十六烷烃降解中3个关键的中间代谢产物，认识到产甲烷条件下外源CO2作为电子受体参与正十六烷烃的降解，但与文献报道的硝酸盐还原条件、硫酸盐还原条件下发生的羧化反应、延胡索酸结合反应不同，是一种尚未阐明的代谢途径；（2）对富集物在125、159和223d微生物结构类群进行T-RFLP分析，发现Syntrophaceae可能是其降解代谢的关键类群。以可能的中间代谢产物为碳源进行传代培养，发现石油烃降解关键的细菌类群Syntrophaceae丰度显著增高，为定向分离石油烃关键的细菌类群提供可行方法；（3）通过T-RFLP和克隆测序技术分析了高温（55℃）正十六烷烃富集物群落结构和演化情况，试验结果发现古菌类群主要是氢营养型产甲烷古菌Methanothermobacter和乙酸营养型古菌Methanosaeta，超过80%细菌克隆序列与现有已知菌株序列相似性低于90%，属于未培养微生物，可能作为重要的参与者参与高温条件下正十六烷烃降解代谢作用；（4）底物刺激、生物强化的方法能够提高不同成熟度煤样的生物产气潜力，个别高成熟度的煤样在不添加营养物和外源接种物情况下，也能观测到生化甲烷的现象。研究微生物厌氧降解不同成熟度煤样的产气潜力，可为煤层气储量评估及开发提供理论依据和方法。 【关键词】：正十六烷烃 产甲烷条件 中间代谢产物 群落结构 煤层甲烷
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：X172
【目录】：

• 摘要6-7
• Abstract7-15
• 第一章 绪论15-25
• 1.1 研究背景15
• 1.2 研究目的和意义15-16
• 1.3 国内外研究现状16-22
• 1.3.1 延胡索酸结合的反应启动烃的降解16-19
• 1.3.2 通过羧化反应启动烃的降解19-22
• 1.3.3 其他反应启动烃的降解22
• 1.4 其他领域中厌氧微生物在难降解化合物的应用22-23
• 1.5 生物质谱学技术在代谢途径中的发展23-25
• 第二章 产甲烷条件下正十六烷烃降解中间代谢产物初探25-59
• 2.1 研究方法与技术路线25-26
• 2.1.1 研究方法25
• 2.1.2 技术路线25-26
• 2.2 实验材料26
• 2.2.1 样品富集物来源26
• 2.2.2 主要试验仪器和试剂26
• 2.3 实验方法26-32
• 2.3.1 富集培养26-27
• 2.3.2 试验方案设计27-28
• 2.3.3 气体组分分析28
• 2.3.4 中间代谢产物样品预处理28
• 2.3.5 GC-MS 代谢产物作样分析步骤28-29
• 2.3.6 微生物分子生态学分析方法29-32
• 2.4 结果与分析32-56
• 2.4.1 产甲烷条件下十六烷烃降解富集物生物地球化学特征32-34
• 2.4.2 GC-MS 分析可能的中间代谢物34-45
• 2.4.3 不同碳源情况下可能代谢产物上的差异45-47
• 2.4.4 可能中间代谢物微生物驯化培养47-49
• 2.4.5 产甲烷条件下正十六烷烃代谢相关分子生物学研究49-56
• 2.5 讨论56-59
• 2.5.1 代谢物与生物过程或生物状态之间的关联56-57
• 2.5.2 产甲烷条件下十六烷烃降解可能的代谢途径探讨57-59
• 第三章 高温产甲烷条件下烃厌氧降解富集物群落结构解析59-68
• 3.1 试验目的59
• 3.2 试验材料59
• 3.3 富集培养59
• 3.4 分析方法59-60
• 3.4.1 气体组分分析59
• 3.4.2 DNA 提取和 PCR 扩增59
• 3.4.3 16S rRNA 克隆文库的构建59
• 3.4.4 T-RFLP 前处理及上样分析59-60
• 3.5 结果与分析60-66
• 3.5.1 正十六烷烃降解产甲烷趋势60
• 3.5.2 系统发育学分析60-66
• 3.6 讨论66-68
• 第四章 不同成熟度煤样产甲烷潜力的研究68-81
• 4.1 试验目的68
• 4.2 试验材料68
• 4.2.1 样品来源68
• 4.3 实验方法68-71
• 4.3.1 主要试剂和仪器68-69
• 4.3.2 无机盐培养基制备69
• 4.3.3 厌氧富集培养69
• 4.3.4 气体组分分析69-70
• 4.3.5 煤样物理化学性质检测70
• 4.3.6 煤炭中微生物 DNA 提取、454 测序70-71
• 4.4 结果与分析71-80
• 4.4.1 煤样的物理和化学性质分析71
• 4.4.2 实验室条件下模拟煤炭厌氧产甲烷试验71-80
• 4.5 讨论80-81
• 第五章 全文总结、工作不足与展望81-84
• 5.1 全文总结81-83
• 5.1.1 产甲烷条件下正十六烷烃中间代谢物81
• 5.1.2 产甲烷条件下正十六烷烃代谢相关分子生物学研究81-82
• 5.1.3 高温产甲烷条件下烃厌氧降解富集物群落结构解析82
• 5.1.4 不同成熟度煤生化甲烷潜力的研究82-83
• 5.2 工作不足与展望83-84
• 5.2.1 中间代谢产物定性研究83
• 5.2.2 以中间代谢产物为碳源富集培养需更深一步研究83
• 5.2.3 高温正十六烷烃降解富集物菌种资源需更进一步研究83
• 5.2.4 煤层生化甲烷生物学降解过程需更深一步研究83-84
• 参考文献84-94
• 致谢94-95
• 作者简历95

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