污泥中产甲烷细菌多样性及产甲烷效能的优化研究

【摘要】：厌氧消化法是目前国际上处理城镇污泥应用最为广泛的方法,可使污泥减量化和资源化。厌氧消化过程中产生沼气的主要成分甲烷与氧气混合燃烧后能产生大量能量,能源效率明显高于薪柴、秸秆、煤炭等,因此厌氧消化在能源消费巨大、提倡节能减排的中国极具实际应用前景。产甲烷菌不仅作为厌氧消化微生物的核心,同时也是自然界碳素循环厌氧发酵的最后一个组成成员,产甲烷菌种的优劣直接影响厌氧消化效率的高低,因此获得高效稳定的产甲烷菌是十分有意义的。 本文首先富集5种污泥或沼液样品以获得产甲烷优势菌群,并结合变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术分析产甲烷菌群结构的多样性,再以累积产生甲烷量为指标选择甲烷产气量最多的样品用于研究各因素对产甲烷菌的影响,在此基础上采用响应面法优化产甲烷菌的产甲烷效能。在对5种污泥样品产甲烷菌群传代培养过程中发现,经过4次的传代培养后产甲烷菌的产甲烷能力均有不同程度的提高,其中累积产甲烷量最多的是实验室厌氧消化污泥,为3.964L/L,累积产甲烷量最少的是林家厌氧消化池污泥沼液,仅为1.691L/L。对5种厌氧菌群PCR-DGGE图谱分析显示,5种样品的微生物菌群都较为丰富,对DGGE条带的序列分析发现11种古菌与已有序列的相似性都在98%以上,优势菌群分属于甲烷鬃毛甲烷菌属(Methanosaeta)、甲烷粒菌属(Methanocorpusculum)、产甲烷菌属(Methanogenium)、甲烷囊菌属(Methanoculleus)、甲烷微菌属(Methanomicrobials)、甲烷八叠球菌属(Methanosarcina)和甲烷盘菌属(Methanoplanus)。因厌氧消化污泥菌群富集效果最好,累积产甲烷量最大,因此在研究产甲烷菌的影响因素及产甲烷效能的优化中选取此样品作为对象进行后续研究。 在研究影响产甲烷菌的各因素时,主要设定pH、接种量、氯化镍、氯化钴、硫酸亚铁5种因素开展研究。研究发现：pH为6.8时,累积产甲烷量、污泥生物量、甲酸利用率、比产甲烷速率呈现最大值,当pH为7.0时,甲烷含量、甲醇利用率、乙酸利用率呈现最大值。接种量在10%时,甲烷含量、累积产甲烷量、末端pH以及3种底物的利用率均呈现最大值。当在硫酸亚铁浓度分别为0.15g/L、0.20g/L时,累积产甲烷量和生物量分别达到最大值4.07L/L和0.468g/L。当氯化钴和氯化镍浓度分别0.15g/L和0.03g/L时,产甲烷菌的各个生理指标均呈现最大值。 在各因素对产甲烷影响研究基础上,仍以上述5种因素作为主要因素,以累积产甲烷量作为响应值,运用Box-Behnken的中心组合设计方法,设计5因素2水平共46组实验点进行响应面分析。经过响应面结果及方差分析,获得最佳实验条件：pH6.8,接种量13.29%, CoCl20.15g/L, NiCl20.02g/L和FeSO40.19g/L。在此条件下的累积产甲烷量达到4.21L/L,比经4次富集之后的产甲烷菌群累积产甲烷量高出6.21%,与模型预测值相近,说明此模型能够真实反应各种主要因素对累积产甲烷量的影响。 【关键词】：厌氧消化污泥 DGGE 产甲烷菌群 累积产甲烷量 响应面法
【学位授予单位】：东北林业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：X703;TQ221.11;X172
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-11
• 1 绪论11-22
• 1.1 产甲烷菌概述11
• 1.2 产甲烷菌的生物学分类11-12
• 1.3 产甲烷菌的代谢途径及独特的辅酶12-15
• 1.3.1 产甲烷菌代谢底物及代谢途径12-14
• 1.3.2 独特的产甲烷菌辅酶14-15
• 1.4 产甲烷菌的影响因素15-17
• 1.4.1 pH对产甲烷菌的影响15-16
• 1.4.2 温度对产甲烷菌的影响16-17
• 1.4.3 氧化还原电位对产甲烷菌的影响17
• 1.4.4 微量元素对产甲烷菌的影响17
• 1.4.5 氮氧化物对产甲烷菌的影响17
• 1.5 变形梯度凝胶电泳在微生物生态研究中的应用17-18
• 1.5.1 变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术的原理18
• 1.5.2 变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术的应用18
• 1.6 响应面优化法18-20
• 1.6.1 响应面优化法的特点19
• 1.6.2 Plackett-Burman实验设计19-20
• 1.6.3 Box-Behnken设计20
• 1.6.4 中心组合设计20
• 1.7 本论文的研究目的及主要内容20-22
• 2 产甲烷菌群传代培养及菌群结构多样性分析22-36
• 2.1 材料22-23
• 2.1.1 实验材料22
• 2.1.2 培养基22-23
• 2.1.3 药品23
• 2.1.4 主要仪器与设备23
• 2.2 主要试剂配制方法23-24
• 2.3 试验方法24-27
• 2.3.1 菌群传代培养方法24
• 2.3.2 厌氧发酵产甲烷实验方法24-25
• 2.3.3 总气体产生量测定方法25
• 2.3.4 甲烷含量测定方法25
• 2.3.5 混合菌群总DNA提取方法25-26
• 2.3.6 PCR扩增方法26
• 2.3.7 DGGE电泳26
• 2.3.8 DGGE条带分析26-27
• 2.4 结果与分析27-34
• 2.4.1 产甲烷菌群的富集27-31
• 2.4.2 产甲烷菌的生长和产甲烷的关系31-32
• 2.4.3 利用PCR-DGGE技术对产甲烷菌群的结构分析32-34
• 2.5 讨论34
• 2.6 本章小结34-36
• 3 产甲烷效能的影响因素36-49
• 3.1 材料36-37
• 3.1.1 实验材料36
• 3.1.2 培养基36
• 3.1.3 药品36
• 3.1.4 仪器与设备36-37
• 3.2 试验方法37
• 3.2.1 厌氧发酵产甲烷实验方法37
• 3.2.2 总气体产生量测定方法37
• 3.2.3 甲烷含量测定方法37
• 3.2.4 挥发酸浓度测定方法37
• 3.2.5 产甲烷指标的计算方法37
• 3.3 结果与分析37-47
• 3.3.1 pH对产甲烷效能的影响37-39
• 3.3.2 接种量对产甲烷效能的影响39-41
• 3.3.3 钻离子对产甲烷效能的影响41-43
• 3.3.4 镍离子对产甲烷效能的影响43-45
• 3.3.5 铁离子对产甲烷效能的影响45-47
• 3.4 讨论47-48
• 3.5 本章小结48-49
• 4 响应面法优化产甲烷菌产甲烷效能49-57
• 4.1 材料49
• 4.1.1 实验材料49
• 4.1.2 培养基49
• 4.1.3 药品49
• 4.1.4 仪器与设备49
• 4.2 试验方法49-50
• 4.2.1 厌氧发酵产甲烷实验方法49-50
• 4.2.2 总气体产生量测定方法50
• 4.2.3 甲烷含量测定方法50
• 4.2.4 产甲烷指标的计算方法50
• 4.3 结果与分析50-55
• 4.3.1 响应面法实验设计50
• 4.3.2 响应面实验结果与分析50-53
• 4.3.3 响应面分析53-55
• 4.3.4 最优条件确立及模型验证实验55
• 4.4 讨论55-56
• 4.5 本章小结56-57
• 结论57-58
• 参考文献58-62
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文62-63
• 致谢63-64

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