闽江河口区盐度梯度下潮汐沼泽湿地产甲烷菌群落结构及对环境因子的响应

【摘要】：河口潮汐沼泽湿地位于河流与海洋交汇处,是天然湿地重要的组成部分,可作为研究河口湿地功能微生物群落的模式环境之一。产甲烷菌(Methanogenic archaea, MA)是湿地甲烷产生的功能菌群,在甲烷代谢中发挥着重要作用。盐度是入海河口区一个十分重要的环境因子,因此,研究盐度变化对河口潮汐沼泽湿地产甲烷菌的影响具有重要的生态学意义。本论文以福建省闽江河口区盐度梯度下分布的短叶茳芏潮汐沼泽湿地土壤为研究对象,通过土壤总DNA的提取、mcrA基因的扩增、克隆文库的建立、限制性片段长度多态性(RFLP)分析和测序以及实时荧光定量PCR(Real-time PCR)等一系列分子生物学手段,研究位于鳝鱼滩和蝙蝠洲的短叶茳芏半咸水潮汐沼泽湿地土壤以及位于塔礁洲和下洋洲的短叶茳芏淡水潮汐沼泽湿地土壤产甲烷菌的群落组成和丰度,及其对盐度、pH、氧化还原电位(Eh)和土壤有机碳(SOC)的响应,探讨短叶茳芏沼泽湿地土壤中产甲烷菌群落结构。论文的主要研究内容与结果如下：(1)闽江口短叶茳芏潮汐沼泽湿地土壤产甲烷菌的类群有甲烷微菌目(Methanomicrobiales),包括Methanoregula、甲烷绳菌属(Methanolinea)、产甲烷菌属Methanogenium)、甲烷嚷菌属(Methanoculleus)、甲烷泡菌属(Methanofollis)、.甲烷盘菌属(Methanoplanus);甲烷杆菌目(Methanobacteriales),包括Methanobrevibacter和甲烷杆菌属(Methanobacterium)以及甲烷八叠球菌目(Methanosarcinales),包括Methanococcoides、甲烷叶菌属(Methanolobus)、甲烷食甲基菌属(Methanomethylovorans)、甲烷八叠球菌(Methanosarcina)和甲烷叶菌属(Methanolobus)。其中Methanoregula是闽江河口区4个短叶茳芏潮汐沼泽湿地的主要类群,在整个产甲烷菌群落中所占比例为44.1%。(2)对产甲烷菌特异的mcrA基因克隆文库进行分析得出,位于下洋洲和塔礁洲的淡水潮汐沼泽湿地和位于鳝鱼滩和蝙蝠洲的半咸水潮汐沼泽湿地土壤中MA群落结构有发生变化。其中淡水湿地土壤中产甲烷菌的主要优势类群有Methanoregula, Methanosarcina, Methanobacterium, Methanolinea,随着盐度的增加,半咸水湿地土壤中产甲烷菌的主要优势类群虽然也包括Methanoregula, Methanolinea, Methanosarcina, Methanobacterium,但以Methanoregula为主。位于下洋洲和塔礁洲的淡水潮汐沼泽湿地与位于鳝鱼滩和蝙蝠洲的半咸水潮汐沼泽湿地土壤产甲烷菌丰度也有显著性差异(P0.05),变化范围在3-56×107copy g-1. 基于RFLP的典范对应分析(CCA))表明：产甲烷菌群落组成与土壤电导率和SOC具有显著的相关性(P(电导率)=0.041,P (soc)=0.045),与pH和Eh不具有显著的相关性(Po.05)。方差分析表明：产甲烷菌群落丰度随着盐度的增加而减少(但相关性较弱,R2=0.513,P0.05),而与SOC、pH和Eh不具有显著相关性(P (SOC=0.742, P(PH))=0.794, P (Eh)=0.781)。 【关键词】：产甲烷菌 PCR-RFLP real-timePCR 丰度 群落结构 淡水和半咸水沼泽 闽江河口
【学位授予单位】：福建师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：Q938
【目录】：

• 中文摘要2-4
• Abstract4-6
• 中文文摘6-8
• 目录8-11
• 绪论11-31
• 一 研究背景11-13
• 二 研究的内容、目的和意义13-15
• 三 文献综述15-31
• 3.1 产甲烷菌简介15
• 3.2 产甲烷菌种类的多样性15-17
• 3.3 产甲烷菌代谢多样性17-18
• 3.4 湿地产甲烷菌多样性检测的标记基因18-23
• 3.4.1 16S rRNA基因作为遗传标记基因18-20
• 3.4.2 功能基因作为遗传标记基因20-23
• 3.5 湿地产甲烷菌群落结构研究的分子生物学技术23-29
• 3.5.1 产甲烷菌多样性分析的分子方法24-26
• 3.5.2 产甲烷菌丰度分析的分子方法26-29
• 3.6 影响自然湿地产甲烷菌多样性和丰度的环境因子29-31
• 3.6.1 盐度29-30
• 3.6.2 底物30
• 3.6.3 植物30-31
• 第一章 闽江河口区潮汐沼泽湿地土壤产甲烷菌的群落组成分析31-55
• 第一节 材料与方法31-38
• 1.1 试验材料31-33
• 1.1.1 主要仪器和试剂31-32
• 1.1.2 研究样地概况32-33
• 1.1.3 土壤样品33
• 1.2 方法33-38
• 1.2.1 土壤总DNA的提取33-34
• 1.2.2 土壤样品mcrA基因的扩增和纯化34-35
• 1.2.3 感受态细胞制备35
• 1.2.4 mcrA基因克隆文库的构建35-37
• 1.2.5 mcrA基因的RFLP分析,测序和系统发育数的构建37
• 1.2.6 多样性比较分析37-38
• 第二节 结果与分析38-52
• 2.1 湿地土壤总DNA的提取38
• 2.2 mcrA基因的扩增和纯化38-39
• 2.3 mcrA基因克隆文库的构建39
• 2.4 mcrA基因的RFLP分析39-42
• 2.4.1 半咸水沼泽湿地mcrA基因的RFLP分析39-41
• 2.4.2 淡水沼泽湿地mcrA基因的RFLP分析41-42
• 2.5 mcrA基因的多样性比较42-43
• 2.6 mcrA基因序列分析43-49
• 2.6.1 半咸水沼泽湿地mcrA基因系统发育分析43-44
• 2.6.2 淡水沼泽湿地mcrA基因系统发育分析44-49
• 2.7 产甲烷菌群落结构的比较49-52
• 2.7.1 4个湿地产甲烷菌群落结构的比较49-51
• 2.7.2 产甲烷菌群落结构的垂直结构51-52
• 第三节 讨论52-55
• 3.1 不同盐度湿地的产甲烷菌群落结构53-54
• 3.2 产甲烷菌群落结构的垂直变化54-55
• 第二章 闽江河口区潮汐沼泽湿地土壤产甲烷菌的数量分析55-65
• 第一节 材料与方法55-58
• 1.1 试验材料55-56
• 1.1.1 主要仪器和试剂55-56
• 1.2 样本采集56
• 1.3 方法56-58
• 1.3.1 DNA的提取56
• 1.3.2 构建DNA标准品56-57
• 1.3.3 荧光定量PCR扩增曲线的建立57-58
• 第二节 结果与分析58-63
• 2.1 16S rDNA标准质粒的构建58-59
• 2.2 16S rDNA质粒标准曲线的建立59
• 2.3 扩增曲线图的建立59-60
• 2.4 融解曲线分析60-61
• 2.5 荧光定量结果61-63
• 第三节 讨论63-65
• 第三章 闽江河口区产甲烷菌群落结构与土壤环境因子的响应65-71
• 第一节 材料与方法65
• 1.1 土壤样品的理化性质分析65
• 第二节 结果与分析65-69
• 2.1 产甲烷菌的群落结构与土壤环境因子的关系67-68
• 2.2 产甲烷菌的数量与环境因子的关系68-69
• 第三节 讨论69-71
• 第四章 结论与展望71-75
• 4.1 结论71-72
• 4.2 展望72-75
• 参考文献75-85
• 攻读学位期间承担的科研任务与主要成果85-87
• 致谢87-89
• 个人简历89-90

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