活性污泥中甲烷菌的研究

【摘要】：一、探讨污泥干化芦苇床稳定化污泥中甲烷氧化菌多样性,利用PCR-DGGE技术分析不同时期、不同干化床污泥中甲烷氧化菌群落变化。通过对DGGE图谱的聚类分析了不同样品的相似度。计算1单元到3单元芦苇床污泥样品随着不同月份变化得出的香农-威纳(Shano-Wiener)指数分别为2.03、1.09、1.87,2.04、1.36、1.95,1.59、1.17、1.92,均匀指数分别为0.99、0.97、0.95,0.97、0.98、0.99,0.95、0.97、0.99,即随着不同月份的改变,1单元干化床的均匀指数均下降,2、3单元干化床的均匀指数均上升。利用测序后得到的序列进行亲缘性比对,并结合优势种属的变化分析污泥样品甲烷氧化菌群落的演替。结果表明,污泥干化芦苇床污泥样品中甲烷氧化菌的多样性,可以通过PCR-DGGE分析。同一时期不同干化床污泥中甲烷氧化菌群落相似度较高；而同一干化床、不同时期污泥中的甲烷氧化菌群落有一定的差异。污泥干化芦苇床中优势种属主要随芦苇生长时期和污泥稳定化时间的延长而改变。基于序列和系统发育树分析,干化床污泥样品中主要的优势菌属是未培养的Ⅰ型甲烷氧化菌,表明有通气结构的芦苇床更能有效氧化甲烷,有利于减少甲烷的排放。二、从2单元污泥干化芦苇床样品中分离筛选出Ⅱ型甲烷氧化菌。利用涂平板,进行稀释分离。本菌株的分类,可以根据不同相的分类方法。结果表明,菌株W5在培养基中生长良好,粉红色,根据系统发育、形态特征、等分析表明菌株W5属于甲基杆菌属(Methylobacter)。三、利用厌氧技术从3单元污泥干化床中分离出一株产甲烷菌株C5,在荧光显微镜下观察该菌落有蓝绿色荧光。通过对C5菌株的16S rDNA进化地位分析,它与甲烷八叠球菌属的相似性最大99%,根据系统发育树分析以及形态学分析此菌株为甲烷八叠球菌属(Methanosarcina)。 【关键词】：污泥干化芦苇床 甲烷氧化菌 产甲烷菌 16s rDNA DGGE 多样性
【学位授予单位】：大连工业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：X703;X172
【目录】：

• 摘要4-5
• Abstract5-10
• 第一章 绪论10-19
• 1.1 研究背景10
• 1.2 甲烷菌的简介10-16
• 1.2.1 产甲烷菌11-13
• 1.2.1.1 产甲烷菌研究进展和生长环境11-12
• 1.2.1.2 产甲烷菌的分类和多样性和生理12-13
• 1.2.1.3 产甲烷菌合成甲烷途径13
• 1.2.2 甲烷氧化菌13-16
• 1.2.2.1 甲烷氧化菌特征酶14-16
• 1.2.2.2 甲烷氧化菌的形态与分类16
• 1.2.2.3 甲烷氧化的途径16
• 1.3 产甲烷菌和甲烷氧化菌的潜在应用价值16
• 1.4 聚合酶链式反应(PCR)16-17
• 1.5 降落PCR17
• 1.6 本课题研究工作17-19
• 1.6.1 本课题研究内容17-18
• 1.6.2 本课题研究意义18-19
• 第二章 基于PMOA基因分析污泥干化芦苇床中甲烷氧化菌的多样性19-30
• 2.1 实验材料19-21
• 2.1.1 样品采集19
• 2.1.2 实验试剂19-20
• 2.1.3 实验仪器20-21
• 2.1.4 溶液配制21
• 2.2 实验方法21-23
• 2.2.1 样品DNA提取21-22
• 2.2.2 样品DNA纯化22
• 2.2.3 PMOA基因PCR扩增22
• 2.2.4 PCR-DGGE条件22
• 2.2.5 切胶和测序22-23
• 2.2.6 DGGE图谱分析和数据处理23
• 2.2.7 DGGE图谱聚类分析23
• 2.2.8 系统发育树的构建23
• 2.3 结果与讨论23-29
• 2.3.1 总DNA的提取23-24
• 2.3.2 基于PMOA基因PCR扩增24-25
• 2.3.3 引物带有GC-夹进行PCR扩增25-26
• 2.3.4 D GGE图谱分析26-28
• 2.3.5 多样性指数分析28
• 2.3.6 DGGE图谱聚类分析28-29
• 2.4 本章小结29-30
• 第三章 污泥干化芦苇床中甲烷氧化菌的分离与鉴定30-38
• 3.1 实验材料30-31
• 3.1.1 污泥样品采集30
• 3.1.2 实验试剂30-31
• 3.1.3 实验仪器31
• 3.2 实验方法31-33
• 3.2.1 培养基配制31
• 3.2.2 甲烷氧化菌的筛选31-32
• 3.2.2.1 污泥样品的预处理31
• 3.2.2.2 甲烷氧化菌的分离与纯化31-32
• 3.2.3 菌株的形态观察32
• 3.2.4 甲烷气体分析方法32
• 3.2.5 16SRDNA分析和构建发育树32-33
• 3.2.5.1 菌体DNA提取32
• 3.2.5.2 16SRDNA PCR扩增32-33
• 3.2.5.3 构建系统发育树33
• 3.3 结果与讨论33-37
• 3.3.1 菌体形态33-34
• 3.3.2 甲烷浓度34
• 3.3.3 菌体的DNA34
• 3.3.4 16SRDNA PCR扩增34-35
• 3.3.5 系统发育树的构建35-37
• 3.4 本章小结37-38
• 第四章 产甲烷菌的分离与鉴定38-46
• 4.1 实验材料38-39
• 4.1.1 污泥样品采集38
• 4.1.2 实验试剂38
• 4.1.3 实验仪器38-39
• 4.2 实验方法39-42
• 4.2.1 培养基配制39
• 4.2.2 产甲烷菌的筛选39-40
• 4.2.2.1 污泥样品的预处理39
• 4.2.2.2 产甲烷菌培养39-40
• 4.2.2.3 产气实验40
• 4.2.2.4 形态观察和倒置荧光显微镜观察40
• 4.2.2.5 扩大培养40
• 4.2.3 菌体DNA的提取40-41
• 4.2.4 16SRDNA PCR扩增41-42
• 4.2.5 构建系统发育树42
• 4.3 结果与讨论42-45
• 4.3.1 产气实验42
• 4.3.2 倒置荧光显微镜观察42-43
• 4.3.3 16SRDNA PCR扩增43-44
• 4.3.4 构建系统发育树44-45
• 4.4 本章小结45-46
• 第五章 结论46-47
• 参考文献47-50
• 致谢50

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