厌氧烃降解产甲烷菌系的组成及其代谢产物的特征

【摘要】：石油烃厌氧降解产甲烷过程的研究对于深入认识油藏环境石油烃厌氧降解、油污染环境微生物修复以及残余油气化技术具有重要的理论意义和实用价值。目前,对于厌氧烃降解产甲烷过程的研究大多都基于实验室培养研究,对于长期培养的厌氧烃降解产甲烷菌系的组成及其变化的研究却很有限。本文利用不同来源样品(油藏产出液和含油活性污泥)成功地构建了两个厌氧烃降解产甲烷菌系,通过分子生物学和化学分析方法,研究了这两个菌系的菌群组成、功能基因以及代谢产物的特征,探讨了菌系中的菌群动态变化和可能存在的代谢机制。 提出了一种由羧酸合成特定位置氘代烷烃的“两步法”,壬酸发生a位置氘代和Kolbe电解反应,在优化的反应条件下制备8,8,9,9-d4-十六烷,用作厌氧烃降解培养的底物进行代谢途径的研究。该方法也可以用于合成其它相邻两个碳原子氘代的烷烃。 以油藏产出液为基础,构建了高温厌氧烃降解产甲烷菌系。加入混合烷烃(C15-C20)在55℃富集培养749天的样品中检测到141μmol甲烷,约占理论产甲烷量的17.1%。GC-MS检测到多种可能的下游代谢产物(包括直链脂肪酸、挥发性脂肪酸和延胡索酸)存在,同时说明从烷烃到甲烷的转化并不完全。16S rRNA基因克隆文库分析表明,该厌氧烃降解产甲烷菌系的菌群结构在培养过程中发生了变化。长期加烃富集培养体系中细菌是以Firmicutes的Gelria和Moorella为主,古菌的主要类型为Crenarchaeotes以及氢营养型产甲烷菌。另外,富集培养样品中都检测到了类似于编码烷基琥珀酸合成酶α-亚基的功能基因(assA),特别在培养749天的样品中检测到一种不同类型的assA基因,说明富集培养中存在着有烃降解功能的微生物。在该加烃富集培养中可能存在的厌氧烃降解产甲烷代谢途径为：在Firmicutes和Crenarchaeotes类型厌氧菌的作用下,烷烃可能通过延胡索酸加成的方式进行初始活化,再被连续降解为脂肪酸之后,转化为甲酸、乙酸、氢气和二氧化碳,并由乙酸营养型和氢营养型产甲烷菌利用产生甲烷,产甲烷过程以二氧化碳还原途径为主。 含油活性污泥菌系中,加入混合烷烃(C15-C20)在37℃富集培养后,检测到314μmol甲烷产生,有37.3%的烷烃被消耗。分子生物学分析发现,培养过程中菌群结构发生了显著变化,最终细菌的主要类型为Clostridia、Actinobacteria、Synergistaceae和Chloroflexi,古菌是以乙酸营养型产甲烷菌为主。将富集培养406天的不加烃对照分别加入十六烷、全氘代十六烷和8,8,9,9-d4-十六烷进行转接,经过660天的培养,均检测到甲烷的产生和烷烃的消耗。特别是在加入8,8,9,9-d4-十六烷的转接培养中,甲烷的产量为107μmol,约占理论产甲烷量的83.6%,这也进一步证明该菌系具有厌氧烃降解产甲烷的活性。系统发育分析显示,所有转接培养样品中都检测到assA类基因,菌群结构也都经历了一些变化,最终细菌的主要类型为Chloroflexi、Synergistaceae、Actinobacteria和Deltaproteobacteria,古菌以乙酸营养型产甲烷菌为主,但在产甲烷活性较高的加入8,8,9,9-d4-十六烷的转接培养则是以氢营养型产甲烷菌为主。在该转接培养中,烷烃可能通过延胡索酸加成的方式进行初始活化,并由大量共生发酵菌将烷烃连续厌氧转化为小分子物质(如乙酸),再由乙酸营养型和氢营养型产甲烷菌利用产生甲烷,并以二氧化碳还原产甲烷的途径为主。 通过对上述两个不同来源的厌氧烃降解产甲烷菌系的分析发现,它们的菌群组成等方面存在明显差异,含油活性污泥中富含有机质,使得菌群结构更为多样。这也说明不同的样品来源、底物以及培养条件会对厌氧烃降解产甲烷菌系的菌群组成产生影响,可能也会影响整个菌系实际厌氧烃降解产甲烷的能力。本文的研究结果丰富了厌氧烃降解产甲烷微生物的多样性,增加了对于厌氧烃降解产甲烷菌群结构变化的了解,也拓展了对于功能基因等方面的认识,对厌氧烃降解产甲烷机制的研究、功能微生物的筛选和评价以及厌氧烃降解产甲烷活动的监测具有重要价值。 【关键词】：厌氧烃降解 产甲烷 菌群组成 烷基琥珀酸合成酶 代谢产物
【学位授予单位】：华东理工大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：X703
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-14
• 第1章 前言14-36
• 1.1 厌氧烃降解的研究概况14-15
• 1.2 厌氧烃降解微生物15-20
• 1.2.1 芳烃厌氧降解微生物15-17
• 1.2.2 烷烃厌氧降解微生物17-19
• 1.2.3 厌氧烃降解微生物的培养19-20
• 1.3 厌氧烃降解的代谢方式20-26
• 1.3.1 脱氢羟基化21
• 1.3.2 延胡索酸加成21-24
• 1.3.3 可能和未知的方式24-25
• 1.3.4 厌氧烃降解代谢途径的推测25-26
• 1.4 厌氧烃降解的代谢产物26-30
• 1.4.1 代谢产物的类型27-28
• 1.4.2 代谢产物的分析28-30
• 1.5 氘代烷烃的合成30-34
• 1.5.1 氘代烷烃的应用30
• 1.5.2 氘代烷烃的合成方法30-31
• 1.5.3 Kolbe电解法31-34
• 1.6 本文研究目的与意义34-35
• 1.7 本文研究思路35-36
• 第2章 特定位置氘代十六烷的合成36-56
• 2.1 材料与方法36-43
• 2.1.1 仪器36
• 2.1.2 试剂36-37
• 2.1.3 壬酸α位置氘代反应37-38
• 2.1.4 Kolbe电解反应38-41
• 2.1.5 反应产物的分析41-43
• 2.2 结果与讨论43-54
• 2.2.1 壬酸α位置氘代反应条件的确定43-46
• 2.2.2 Kolbe电解反应条件的确定46-53
• 2.2.3 8,8,9,9-d_4-十六烷的制备53-54
• 2.3 本章小结54-56
• 第3章 厌氧烃降解产甲烷菌系的构建56-66
• 3.1 材料与方法56-59
• 3.1.1 仪器56
• 3.1.2 试剂56-57
• 3.1.3 接种样品来源57
• 3.1.4 培养基的配制57-58
• 3.1.5 富集和转接培养58-59
• 3.1.6 化学分析59
• 3.2 结果与讨论59-65
• 3.2.1 用油藏产出液构建厌氧烃降解产甲烷菌系59-61
• 3.2.2 用含油活性污泥构建厌氧烃降解产甲烷菌系61-65
• 3.3 本章小结65-66
• 第4章 厌氧烃降解产甲烷菌系的菌群组成66-98
• 4.1 材料与方法66-69
• 4.1.1 仪器66
• 4.1.2 试剂66-67
• 4.1.3 DNA的提取67
• 4.1.4 PCR扩增16S rRNA片段和DGGE67-68
• 4.1.5 16S rRNA基因的PCR扩增和克隆文库构建68-69
• 4.1.6 测序及系统发育分析69
• 4.2 结果69-91
• 4.2.1 油藏产出液菌系中细菌的菌群组成69-72
• 4.2.2 油藏产出液菌系中古菌的菌群组成72-75
• 4.2.3 含油活性污泥菌系中细菌的菌群组成75-88
• 4.2.4 含油活性污泥菌系中古菌的菌群组成88-91
• 4.3 讨论91-96
• 4.3.1 油藏产出液菌系中菌群结构的变化91-92
• 4.3.2 油藏产出液菌系中的产甲烷途径92-93
• 4.3.3 含油活性污泥菌系中细菌菌群结构的变化93-94
• 4.3.4 含油活性污泥菌系中古菌菌群结构的变化94-96
• 4.3.5 不同厌氧烃降解产甲烷菌系中菌群组成的差异96
• 4.4 本章小结96-98
• 第5章 厌氧烃降解产甲烷菌系的assA基因和代谢产物98-111
• 5.1 材料与方法98-100
• 5.1.1 试剂98-99
• 5.1.2 PCR扩增assA基因99
• 5.1.3 构建assA基因克隆文库99
• 5.1.4 测序及系统发育分析99
• 5.1.5 代谢产物分析99-100
• 5.2 结果100-107
• 5.2.1 油藏产出液菌系中的assA基因100-101
• 5.2.2 油藏产出液菌系中的代谢产物101-103
• 5.2.3 含油活性污泥菌系中的assA基因103-105
• 5.2.4 含油活性污泥菌系中的代谢产物105-107
• 5.3 讨论107-109
• 5.3.1 油藏产出液菌系中assA基因的动态变化107
• 5.3.2 油藏产出液菌系中可能存在的代谢途径107-108
• 5.3.3 含油活性污泥菌系中assA基因的动态变化108-109
• 5.3.4 含油活性污泥菌系中可能存在的代谢途径109
• 5.4 本章小结109-111
• 第6章 结论与展望111-114
• 6.1 结论111-113
• 6.2 展望113-114
• 参考文献114-132
• 致谢132-133
• 攻读博士学位期间发表的论文情况133-135
• 附录135-136

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