淡水环境中新型酯酶和甲烷氧化菌的筛选与鉴定

【摘要】： 本论文的研究工作涉及环境微生物学的两个不同领域,第一部分是长江淡水微生物宏基因组文库的构建以及新型脂肪酶的筛选;第二部分是稻田淡水中新型甲烷氧化菌株的分离。 1、长江淡水文库中新型脂肪酶的筛选 尽管微生物非肉眼可见,但其是地球生物群落的一个重要的组成部分。在自然环境下,微生物进行独特的却不可缺少的生物转化,产生对地球生命活动非常重要的生物物质,并展现出了地球生命的多样性。其是地球上已知种类最多、数量最大、分布最广的生物类群,据估计仅原核生物数量达4×10~(30)-6×10~(30)。 微生物可以产生两种不同的水解脂肪的酶,分别为酯酶(esterase)(EC 3.1.1.1)和“真正的”脂肪酶(lipase)(EC 3.1.1.3)。两者都可以将甘油三酯分解成脂肪酸和甘油以及进行其逆反应。微生物脂肪酶资源丰富,具有在有机溶剂中稳定性好、广泛的底物特异性、高度的位置选择性和异构体选择性、催化活性高而副反应少等特点,因此被广泛应用于食品加工、新型生物材料、生物传感器等领域。 但是由于目前环境中有99%的微生物都是不可(难)培养的,只有不到1%的微生物能够被人类认识并利用,所以近年来发展起来的宏基因组学就是利用分子生物学技术绕过培养分离方法来对微生物的多样性及其功能进行研究。目前已经通过此技术筛选到大量新的功能基因,例如编码脂肪酶、蛋白酶、腈水解酶、氧化还原酶和淀粉酶等活性物质的基因。长江作为我国主要的淡水资源,蕴含着极其丰富的微生物资源,必然包含着极其多样的活性物质。 本工作是结合了原位裂解微生物获取大片段DNA的方法对安庆长江水段(30°30'11.30 N,117°04'07.70 E)中的微生物资源进行挖掘,构建了宏基因组文库并对该环境中的脂肪酶基因资源进行筛选,得到了一种新型的脂肪酶。EstY含有423个氨基酸,其分子量为44kDa,等电点为7.28。EstY能水解对硝基苯乙酸(C2),对硝基苯丁酸(C4),对硝基苯辛酸(C8),对硝基苯癸酸(C10),对硝基苯月桂酸(C12),对硝基苯豆蔻酸(C14)和对硝基苯棕榈酸(C16)多种对硝基苯脂。其酶活的最适pH为9.0,最适温度为50℃。Mn~(2+)、Co~(2+)、Hg~(2+)、Zn~(2+)、Fe~(3+)强烈的抑制EstY的活性,但EstY却对Mg~(2+)表现出一定的依赖性。此外,EstY在10%浓度的乙醇,丙酮,异丙醇和二甲基亚砜的溶剂里不丧失活性。根据序列保守性和进化树分析,可以初步推断EstY和其相关的七个脂肪酶不属于任何一个已经的细菌脂肪酶家族。 2、稻田淡水中新型甲烷氧化菌株的分离 近年来,温室效应导致的环境问题近年来愈演愈烈,全球气候变暖的趋势日益明显,一些突出的环境问题如病虫害增加、海平面上升、气候冷暖反常、海洋风暴增多、土地干旱、沙漠化等无不与之密切相关。温室气体增多是造成温室效应的主要原因。通常所知,二氧化碳是主要的温室气体,对温室效应的贡献占到了60%以上。不容忽视的是,甲烷同样也是一种重要的温室气体,但以单位分子数而言,甲烷的温室效应要比二氧化碳大上25倍。从这一点上说,降低大气中甲烷的含量比降低二氧化碳对温室效应的防治更为有效。 甲烷氧化细菌是甲基氧化细菌的一个分支,其独特之处在于其能利用甲烷作为唯一的碳源和能源。几乎所有的甲烷氧化菌都是专性好氧甲烷氧化菌,甲烷氧化菌氧化甲烷最终生成二氧化碳,并在此过程中获得生长所需的能量。甲烷氧化菌的典型特征是含有甲烷单加氧酶,可催化甲烷氧化为甲醇,甲醇进一步氧化为甲醛,甲醛再同化为细胞生物量或通过甲酸氧化为二氧化碳重新回到大气的碳库中,即甲烷→甲醇→甲醛→甲酸盐→二氧化碳。甲烷氧化菌于1906年被首次分离,1970年Whittenbury等分离和鉴定了100多种能利用甲烷的细菌,奠定了现代甲烷氧化菌分类的基础。 本课题从合肥郊区(31°52'N,117°17'W)水稻田中分离了一株革兰氏阳性,短杆状,不运动,没有孢子形成的甲烷氧化菌。此菌为专性好氧菌,生长最适温度为30℃,最适pH为pH7.0-8.0,只能在以甲烷为碳源的培养基中生长。根据16SrRNA和pmoA序列比对,发现此菌属于typeⅡ(α-proteobacteria)甲烷氧化菌的其和一些甲基孢囊菌属(Methylocystis)的未鉴定的菌株有非常高的相似度,但不属于已发现的五个甲基孢囊菌属的任何一个种。因此,我们初步推断此菌为甲基孢囊菌属的一个新种(=CGMCC 1.5062=ATCC BAA-1775)。 【关键词】：淡水宏基因组 酯酶 脂肪酶家族 甲烷氧化菌 进化树
【学位授予单位】：中国科学技术大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：Q93
【目录】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-15
• 第1章 绪论(环境宏基因组与甲烷氧化菌研究进展)15-56
• 1.1 引言15-16
• 第一部分 环境宏基因组与脂肪酶的筛选16-31
• 1.2 环境宏基因组研究技术进展16-30
• 1.2.1 环境宏基因组研究概况16-17
• 1.2.2 环境宏基因组的构建17-18
• 1.2.2.1 环境样品总DNA的提取17-18
• 1.2.2.2 载体的选择18
• 1.2.2.3 宿主的选择18
• 1.2.3 环境宏基因组文库的筛选18-23
• 1.2.3.1 文库筛选的可行性分析18-19
• 1.2.3.2 筛选文库的的方法19-21
• 1.2.2.3 各种环境宏基因组文库的筛选21-23
• 1.2.4 从环境宏基因组文库中筛选脂肪酶23-30
• 1.2.4.1 细菌脂肪酶简介23
• 1.2.4.2 细菌脂肪酶的研究概况23-24
• 1.2.4.3 细菌脂肪酶家族24-28
• 1.2.4.4 脂肪酶的用途28-29
• 1.2.4.5 环境中筛选脂肪酶29-30
• 1.3 本研究的目的和意义30-31
• 1.3.1 本研究的目的30
• 1.3.2 本研究的意义30-31
• 第二部分 新型甲烷氧化菌的筛选31-45
• 1.4 甲烷氧化菌研究进展31-43
• 1.4.1 甲烷氧化菌研究背景31-34
• 1.4.1.1 地球上甲烷的来源和消耗方式31-32
• 1.4.1.2 微生物介导的甲烷循环32-33
• 1.4.1.3 甲烷氧化菌概况33-34
• 1.4.1.4 甲烷氧化菌的研究进展34
• 1.4.2 甲烷氧化菌的分类34-35
• 1.4.3 甲烷氧化菌的生态分布35-36
• 1.4.4 甲烷氧化菌的特征酶36-39
• 1.4.5 甲烷氧化菌的研究方法39-43
• 1.4.5.1 以16S rRNA为基础的甲烷氧化菌的生态学研究39-40
• 1.4.5.2 功能性基因探针检测甲烷氧化菌40-41
• 1.4.5.3 变性梯度凝胶电泳(DGGE)和反转录PER方法分析41-42
• 1.4.5.4 磷脂酸和同位素标记技术42-43
• 1.5 本研究的目的和意义43-45
• 1.5.1 本研究的目的43-44
• 1.5.2 本研究的意义44-45
• 参考文献45-56
• 第2章 长江淡水宏基因组文库中新型酯酶的筛选与鉴定56-83
• 2.1 引言56-57
• 第一部分 材料和方法57-70
• 2.2 试验基本材料57-58
• 2.2.1 淡水样品来源57
• 2.2.2 试验所用基本材料和仪器设备57-58
• 2.3 长江水微生物宏基因组库的建立58-60
• 2.3.1 长江淡水表层微生物的提取58
• 2.3.2 长江淡水宏基因组文库的建立58-60
• 2.3.2.1 长江水微生物基因组的提取58-59
• 2.3.2.2 酶切并回收大片段DN A59-60
• 2.3.2.3 构建BAC基因组文库60
• 2.4 新型酯酶的筛选与鉴定60-70
• 2.4.1 筛选带有脂肪酶基因的阳性克隆60
• 2.4.2 对阳性克隆进行亚克隆并测序分析60-70
• 2.4.2.1 菌种保存和扩大培养60-61
• 2.4.2.2 抽出阳性克隆中带有脂肪酶基因的质粒61
• 2.4.2.3 亚克隆以及测序分析61-62
• 2.4.2.4 分析测序结果62-63
• 2.4.2.5 构建EstY蛋白表达质粒63-65
• 2.4.2.6 EstY蛋白的表达与纯化65-67
• 2.4.2.7 EstY的酶活测试67-70
• 第二部分 结果与讨论70-82
• 2.5 宏基因组文库的构建70-73
• 2.5.1 长江水微生物大片段基因组的提取70
• 2.5.2 宏基因组文库的构建70-72
• 2.5.2.1 酶切并回收大片段DNA70
• 2.5.2.2 构建BAC基因组文库70-72
• 2.5.3 结果讨论72-73
• 2.6 新型酯酶的筛选与鉴定73-82
• 2.6.1 筛选带有脂肪酶基因的阳性克隆73
• 2.6.2 对阳性克隆进行亚克隆并测序分析73-76
• 2.6.2.1 亚克隆库的建立74
• 2.6.2.2 亚克隆库的筛选74
• 2.6.2.3 阳性亚克隆的序列分析74-76
• 2.6.3 酯酶基因EstY融合蛋白的表达和纯化76-77
• 2.6.4 EstY的酶活测试77-80
• 2.6.4.1 不同底物的酶活测定77-78
• 2.6.4.2 不同pH对酶活力的影响测定78
• 2.6.4.3 不同温度对酶活力的影响测定78
• 2.6.4.4 不同离子对酶活力的影响测定78
• 2.6.4.5 不同的有机溶剂及去污剂对酶活力的影响测定78
• 2.6.4.6 计算EstY的米氏常数78-80
• 2.6.5 结果讨论80-82
• 参考文献82-83
• 第3章 新型甲烷氧化菌的分离及特性研究83-111
• 3.1 引言83-84
• 第一部分 材料和方法84-100
• 3.2 实验配料84-88
• 3.2.1 试验仪器设备84
• 3.2.2 甲基氧化菌培养基及其它培养基组分84-87
• 3:2.3 其它试剂87-88
• 3.2.4 试验所用引物88
• 3.3 新型甲烷氧化菌的筛选与鉴定88-92
• 3.3.1 取样地点88
• 3.3.2 新型甲烷氧化菌的筛选88-89
• 3.3.3 新型甲烷氧化菌的鉴定89-92
• 3.3.3.1 新型甲烷氧化菌的基因组提取89-90
• 3.3.3.2 对新型甲烷氧化菌16S rRNA序列特异性扩增和测序90-92
• 3.3.3.3 16S rRNA的序列分析92
• 3.3.3.4 新型甲烷氧化菌的形态特征观察92
• 3.3.3.5 菌种保藏92
• 3.4 新型甲烷氧化菌的生理生化遗传学特性研究92-100
• 3.4.1 革兰氏染色法92-93
• 3.4.2 甲烷氧化细菌生长曲线及甲烷降解曲线的测定93
• 3.4.3 甲烷氧化菌温度梯度生长测定93
• 3.4.4 甲烷氧化菌pH梯度生长测定93
• 3.4.5 甲烷氧化细菌NaCl梯度实验方法93-94
• 3.4.6 唯一碳源试验94
• 3.4.7 唯一氮源试验94
• 3.4.8 过氧化氢试验94
• 3.4.9 脲酶测定试验94
• 3.4.10 甲烷氧化细菌特征酶基因pmoA,mxaF和mmoX的鉴定94-97
• 3.4.10.1 pmoA,mxaF和mmoX片段的扩增和测序94-97
• 3.4.10.2 pmoA基因片段的序列分析97
• 3.4.11 甲烷氧化菌的固氮酶基因nifH的鉴定97-100
• 3.4.11.1 固氮酶基因nifH片段的扩增与测序97-99
• 3.4.11.2 固氮酶基因nifH片段的鉴定99-100
• 第二部分 结果与讨论100-109
• 3.5 新型甲烷氧化菌的筛选与鉴定100-109
• 3.5.1 筛选结果100
• 3.5.2 甲烷氧化菌M261的形态特征100
• 3.5.3 甲烷氧化菌M261的鉴定结果与分析100-104
• 3.5.4 甲烷氧化菌M261的生理试验结果104-106
• 3.5.4.1 细菌革兰氏染色结果分析104
• 3.5.4.2 甲烷氧化细菌生长曲线及甲烷降解曲线104
• 3.5.4.3 甲烷氧化菌pH梯度生长结果104-105
• 3.5.4.4 甲烷氧化菌温度梯度生长测定105
• 3.5.4.5 甲烷氧化细菌NaCl梯度生长结果105
• 3.5.4.6 唯一碳源试验105
• 3.5.4.7 唯一氮源试验105
• 3.5.4.8 脲酶测定试验105
• 3.5.4.9 过氧化氢酶试验105-106
• 3.5.5 甲烷氧化菌M261的特征基因分析106-108
• 3.5.5.1 甲烷氧化细菌特征酶基因pmoA和mmoX的鉴定106
• 3.5.5.2 甲烷氧化菌的固氮酶基因nifH的鉴定106
• 3.5.5.3 甲烷氧化菌pmoA的系统发生树分析106-108
• 3.5.6 结果讨论108-109
• 参考文献109-111
• 致谢111-112
• 在读期间发表的学术论文112

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