菊花的组织培养，急用，在线等

热心网友：植物组织培养及其应用目前，生物技术正在世界突飞猛进地发展，而且在医学、农业、食品工业、能源工业、环境保护各个领域显示出极大的生产潜力。作为生物技术有力手段的组织培养，也日益受到重视，组织培养在农林作物的脱毒快繁、突变诱发、细胞工程和基因工程等方面都可以发挥作用。 当前人类正面临淡水资源短缺的困难，同时土地沙荒化、盐渍化也对人类造成威胁。我国是属于淡水资源缺乏的国家，除积极进行节用水，在农业上选育耐旱作物品种以及提高农作物的抗旱性之外，应用细胞工程技术快速繁殖固沙植物，筛选抗旱和抗盐的细胞突变体，以至利用基因工程方法将抗旱基因引入到禾谷类作物中，最终将会对干旱、半干旱及滩涂地区的开发利用产生极大影响。可喜的是，目前科学家们已做出积极努力，在渗透调节基因工程方面取得了有意义的进展。 总之，生物技术的应用将对我国农林生产带来革命性的变化，本节所讲的组织培养的基本原理及其应用，希望能引起读者广泛的兴趣，以便为不久的将来应用生物技术在解决我国旱区的实际问题上，能有所启迪。 一、植物组织培养中的细胞分化与器官建 （一）植物细胞的全能性 植物细胞的全能性即是每个植物的本细胞或性细胞都具有该植物的全套遗传基因，因此在一定培养条件下每个细胞都可发育成一个与母体一样的植株。这个概念虽然在本世纪初已经提出，但在当时的技术条件下，在实践上并没做到，经过几十年来组织培养技术的不断改进，目前细胞的全能性不但在理论上完全被证实，而且为组织培养在实践上的应用奠定了基础。 植物细胞要表现出全能性，须经过几个步骤： 成熟细胞→分生细胞→胚状体→完整植株。 成熟细胞→愈伤组织→出根出芽→完整植株。 脱分化也就是已经分化定型的细胞，经过诱导成为重新恢复了分裂能力（也就是成为分生状态）细胞的过程。 不但植物体细胞可以表现全能性，花粉在培养条件下也可能进行脱分化，通过愈伤组织或胚状体发育成单倍体植株。 植物细胞为什么表现出全能性呢？就要从动物与植物细胞的区别说起。不论是植物、动物还是微生物，其代谢的分子基础基本是一样的，从微生物到人，遗传的信息是一致的。但动物与植物细胞区别还是很大的这差别主要地在于： 第一，自养与异养的差别。高等绿色植物是自养的，对营养的要求较简单，因此培养基的成分大部分为无机物和少量简单有机物。而高等动物是需要多种复杂营养的异养生物，它们从复杂的来源中吸收、消化和同化其营养，并通过血液将养分输送到全身细胞和器官。 第二，外界环境的差别。动物细胞直接所处的内部环境，以上对浓缩的形式来满足其营养要求。植物所处的环境变化大，它中收养分是以稀释的状态。植物细胞束缚在纤维素壁内，内部液泡保持相当稳定的成分。植物细胞又以很大的能力维持着大的液泡、原生质与外界培养基进行物质交换。 第三，胚胎得到养分的方式不同。动物的胚靠预先存在卵里的营养发育，靠胎座与母体联系，植物的胚获得营养方式相对地简单，胚存在于胚囊和胚株中，通过胚乳供应胚的养分，原胚与子叶通过其外表面吸收养分。所以植物细胞诱导成胚从外部取得营养容易，不象动物要通过血液。 第四，器官发育的差别。动物很早就开始器官发育，这些器官有高度特化的功能，然后靠血液循环系统、神经系统、脊髓、大脑、激素把各器官连成整体。并且动物器官的发育过程基本上只有一次，而高等植物重复地产生器官而且是无限的。植物器官的发育是在生长区通过活细胞的活动，如顶端分生组织不断产生叶、芽、花，在这些具有活细胞的部位，可取活细胞进行移植和培养。 诱导细胞的脱分化，需要许多外界条件。任何一个分化的细胞都具有保持分生组织状态的潜势，不过它平常处于受抑制的状态，消除抑制作用就可以使细胞恢复分裂。在各种外界条件中，外源激素对脱分化起重要作用。有些植物的外植体仅需加入生长素（IAA"吲哚乙酸"，NAA"萘乙酸"，2，4-D）即可诱导细胞的分裂与生长，如菊苣；有的仅需加入加细胞激动素类，如大豆、萝卜；另一类需加生长素和细胞激动素类，如烟草髓、胡萝卜、马铃薯；还有一类不需加任何激素，如冠瘿组织，烟草肿瘤组织。 （二）组织的分化与器官建成 1、维管组织的分化 早期研究发现（Wetmore，1955），丁香的芽可以诱导邻近的组织分化出维管束，后证明这是芽中IAA的作用。将一块含有14C-IAA和蔗糖的琼胶楔形物插入到愈伤组织切口中，14C-IAA表明蔗糖和IAA通过琼胶扩散到愈伤组织，从而在愈伤组织中造成这两种物质的梯度，在楔形物一颇有同感形成维管束的瘤状物，瘤状物含有一形成层带，一面形成韧皮部，一面形成木质部，与正常的维管束有类似的排列。增加IAA的浓度，导致木质部形成，增加蔗糖浓度则导致韧皮部形成。生长素水平恒定时，2%蔗糖则全部分化出木质部，4%蔗糖几乎全部分化出韧皮部，3%蔗糖则可以分化出二者。所以，生长素和蔗糖浓度决定愈伤组织中维管束的类型与数量。 Rier和Beslow进一步报道，蔗糖不仅影响细胞的数目，而且影响其结构。低浓度蔗糖（0.5%）诱导出环纹和梯纹管胞，1.5-3.-5%蔗糖诱导出梯纹和网纹细胞。 细胞分裂素类对促进木质部形成也有作用。它们使碳水化合物代谢趋向于五碳糖途径，促进木素前体苯丙烷的合成，不同的细胞分裂素作用不同。玉米素>激动素>6-BA（6-苄基腺嘌呤），NAA/激动素的比值为0.5/20时有木质部发生和根形成，而比值降为0.025/0.4时，只发生木质部而不发生根，赤霉素（GA）、乙烯、脱落酸对木质部发生有抑制作用。 2、根和芽的分化 外植体诱导出愈伤组织后，经过继代培养，可以在愈伤组织内部形成一类分生组织（meristemoid）即具有分生能较往年小细胞团，然后，再分化成不同的器官原基。有些情况下，外植体不经愈伤组织而直接诱导出芽、根。所以器官发生有两种方式，即直接和间接的。 （1）外植体→器官发生（根、芽或胚状体）→再生植株。 （2）外植体→愈伤组织→类分生组织→根、芽→再生植株。 根是组织培养中易形成的器官，早在30年代，就看以胡萝卜培养物中根的形成，以后又在多种植物中看到，同一植物不同器官可以诱导出根来：如棉花幼苗子叶、下胚轴切段、油菜叶片、叶柄、下胚轴等，多种植物愈伤组织也易生根。 形成芽的培养基条件常有不同，有时芽与根可以同时在组织培养中形成，一般说，培养物中形成的芽如胡萝卜悬浮培养，油菜愈伤组织等。在组织培养中通过根、芽诱导再生植株方式有三种：一种在芽产生之后，于芽形成的基部长根而形成小植株，一种是在根上生长出芽来，另一种即在愈伤组织的不同部位分别形成芽和根，然后两者结合起来形成一株植物。 除营养芽之外，在组织培养中有时也有花芽的形成，如烟草、花生等。也有变态器官的形成，如百合鳞片切块分化出的芽，形成小鳞茎，唐菖蒲茎端可诱导形成小球茎，马铃薯的茎切段可以形成块茎。 植物激素的成分影响着器官建成， Skoog和Miller等所提出的生长素和激动素比例决定根和芽分化的观点，曾被大量的试验结果所证明。 在很多禾谷类作物的组织培养中发现，用较高浓度的生长素（2，4-D）诱导形成的愈伤组织，当培养在除去生长素，或适当浓度的活性较低的生长素中时，就可以诱导芽的形成。Nitsch等用Linsmaier(LM)培养基附加10-5摩尔2，4-D培养水稻愈伤组织可以生根，一旦转入无生长素的培养基时就能产生芽。Rangan将小米愈伤组织从含生长素的培养基转移到无生长素的培养基，一个星期内就形成了芽。 但在另一些例子中激素比例控制器官分化的问题则出现完全相反的情况。苜蓿在有2，4-D和细胞分裂素的培养基中，可以形成愈伤组织，转入不加以上两种激素的培养基中能分化，但分化的情况与原来的激素比例有关。如果愈伤组织是在高细胞分裂素/生长素比例的培养基中形成的，易于生根，而在高生长素/细胞分裂素比例的培养基中形成的，易于生根，而在高生长素/细胞分裂素比例的培养基中形成的愈伤组织，则易生芽。由此看来，分化与激素的关系同植物的遗传性有着密切的关系，用五个品种的烟草做实验，用相同的生长素/细胞分裂素比例，结果有的品种形成很多芽，有的形成很少芽，有的完全不生芽。 培养基的物理因素和外界条件对器官建成有一定影响。固体培养基有利于诱导愈伤组织，而液体培养基有利于细胞和胚状体增殖。蓝光有利于芽的分化，而红光、远红光对芽分化有抑制作用，但促进根分化，紫光对生芽有刺激作用。石刁柏、虎耳草属、凤梨科植物分化前期需要低光强（1000勒克斯），后期要求高光强（3000-10000勒克斯），降低氧浓度促进胡萝卜愈伤组织芽的形成，增加氧浓度促进不定根形成。 3、胚状体是指在组织培养吕从一个非合子细胞，通过合子胚相似的胚胎发生过程所形成的胚状结构。从胚状体可以形成完整的植株，这是植株细胞全能性的最强有力的一个证据。 50年代末期，Steward等人从胡萝卜的韧皮部用液体培养基通过游离细胞的分化，获得了胚状体。据统计，在植物组织培养中具有胚状体分化能力的种子植物已达117种，分属43科，75属（见遗传学报5卷1期，1980年）。 在植物组织组织培养中，诱导胚状体与诱导芽相比较，具有显著的优点，一是数量多，二是速度快，三是成苗率高。由于胚状体具有这些优点，所以在育种工作及园艺工作中，可用胚状体作为特定的优良基因型个体的无性繁殖手段，同时在研究胚胎发育中也有很重要的理论意义。 培养基的激素成分和氮源影响胚状体的发生。有的植物可在无激素培养基上诱导出胚状体，如烟草、曼陀萝、水稻、小麦花药培养；有的植物需要生长素与细胞分裂素的一定比例诱导胚状体，如油茶、酸枣、桃等。石龙芮下胚轴，石刁柏愈伤组织，还有一些植物先在有激素的培养基上，然后转入无激素培养诱导胚状体。有人证明培养基中还原态氮对胚状体有利，但我国使用的N5培养基硝酸盐含量高，也有很好的作用。水解酪蛋白或多种氨基酸对胚状体发生有促进效应。 胚状体的发生还与外植体来源和年龄、培养的时间、植物的遗传型等因素有关。 二、植物组织培养的应用 （一）增加遗传变异性，改良作物 单倍体育种：通过花药培养，从小孢子获得单倍体植株，染色体加倍后获得正常二倍体植株，这是一条育种的新途径。单倍体育种可以缩短育种年限，节约人力物力，较快地获得优良品种，目前已有四十多种植物获得了单倍体植株。我国在水稻、小麦、烟草、柏树、橡胶、辣椒等植物的单倍体育种的工作上，处于领先地位。 胚培养、子房培养、胚珠培养：为了克服远缘杂交的不亲和性，可采用胚、子房、胚珠培养和试管受精等手段。最早成功的例子是两个栽培种亚麻的杂交胚发生败育，利有杂种胚培养克服了一些障碍，得到种子。现在在棉花、黄麻上也获得成功。从玉米的离体子房培养，经体外受粉可以得到种子。 突变体的选择和应用：由于植物的单细胞培养成功，可以用这个方法诱发单细胞进行突变，通过筛选所需要的突变体，然后使细胞分化成植株，再通过有性世代使遗传性稳定下来，这是从细胞水平来改造植物的一种途径。除细胞外，愈伤组织、花药、原生质体都可诱发突变。70年代以来，世界各国在这方面已有不少成功的例子，如：已选育出抗花叶病毒的甘蔗无性系，抗1-2%NaCl的野生烟草细胞株，抗除草剂的白三叶草细胞株等。 体细胞杂七杂八交和遗传工程：自1960年以来用酶法获得大量有活力的植物原生质体，现已从四十多种植物的原生质体产生出再生植株。通过异种原生质体的相互融合（即体细胞杂交）为植物育种工作开阔新的途径。原生质体融合的工作自1972年Carlson在两个烟草种间成功以来，现在除种内与种间能获得杂种植株外，在属间甚至不同科的植物间亦做了许多工作，如烟草与大豆、烟草与天仙子、矮牵牛与小花矮牵牛、番茄与矮牵牛等都得到了杂种植株。 此外，通过原生质体融合，并以选择胞质链霉素抗性做手段以转移烟草的雄性不育性状，或通过原生质体融合转移胞质的抗林可霉素因子都得到成功。 原生质体没有胞壁，容易接受外来的引入物质。由于致癌农杆菌可以使多种植物形成肿瘤，以及已发现它所带的Ti质粒可以有效的插入植物细胞的基因组中，所以一些研究者也设想能否以Ti质粒作为载体，与固氮基因重组后转入植物的细胞中，如能实现将固氮基因转到非豆科植物如水稻、小麦、玉米等作物中，则遗传工程在创新植物类型上的前景，无疑是非常广阔的。 （二）繁殖植物 组织培养中从一个单细胞，一块愈伤组织，一个芽（或其它器官）都可以获得无性系。无性系就是用植物体细胞繁殖所获得的后代。用植物组织培养技术繁殖的无性系可概括为五个类型： 原球茎：细胞或组织培养经原球茎途径分化成植株。大部分兰花属于这一类型，即兰花的各个部分的离体组织都能诱导形成原球茎，再经培养分化形成植株。 器官发生型：即从细胞或愈伤组织培养通过不定芽形成植株，如烟草愈伤组织培养分化所得的植株。 胚状体发生型：从细胞或愈伤组织通过胚状体途径，即由球形期、鱼雷期、心形期、子叶期经成熟胚发育成植株，如胡萝卜体细胞培养可通过胚状体途径形成植株。 器官型：从离休珠茎、花芽、叶、鳞片等，亦即从离体的母体组织直接产生小植株，如贝母、百合等。 无菌短枝扦插；选取已发育成熟的腋芽，连同短枝经表面灭菌后在无菌条件下培养，使其生根。腋芽可用生长激素处理促使其萌发。这一方法在较短时间内即可获得一个植株。对保存珍贵的优良树种或花卉品种是简易而有效的方法。 通过组织培养可以做到快速繁殖。1年中从一个芽得到103-106个芽，达到快速目的。现在在国内外已掀起"试管苗"热，许多花卉、林木、果树、蔬菜都可通过组织培养进行大规模的无性繁殖。国外在草莓、苹果、柑桔、兰花、石竹、铁线莲、杜鹃、月季、桉树等进行快速繁殖已达到商品化。我国近年来已获成功的有甘蔗、月季、菊花、无籽西瓜、栎树、山楂、猕猴桃、雪松等。 通过组织培养可以进行无病毒植株的培育。病毒是植物的严重病害，病毒病的种类不下五百多种。受害的粮食作物有水稻、小麦、马铃薯、甘薯，蔬菜作物有：油菜、大蒜，果树有：柑桔、苹果、枣，花卉有：唐菖蒲、石竹、兰花等。防治无方，只好拔除病株，因而造成很大经济损失。病毒在植株上的分布是不均一的，老叶、老的组织和器官病毒含量高，幼嫩的未成熟组织和器官病毒含量较低，生长点几乎不含病毒或病毒较少。1952年法国Morel用生长点培养法获得无病毒植株成功，以后许多国家开展了这方面的工作。目前已在马铃薯、甘薯、大蒜、石竹、百合、兰花、草霉等植物上得到成功。如果采用0.1毫米以下的生长点，则培养时间长（1-1.5年），成活率低，故目前已多用0.1-0.5毫米大小生长点，结合热处理培育无病毒苗。在我国已获得马铃薯无病毒苗，并进行了推广种植，在广东省进行了柑桔无病毒苗的培育。 （三）有用化合物的工业化生产 组织培养除了在农业上的应用外，目前世界各国都在重视另一个方面，即有用化合物的工业化生产。有用化合物包括药物、橡胶、香精油、色素……等。这些化合物许多都是高等植物的次生代谢物，有些化合物还不能大规模地人工合成，而靠植物产生这些化合物来源有限。因此，利用组织培养方法，培养植物的某些器官或愈伤组织，并筛选出高产、高合成能力、生长快的细胞株系，以进行工业化生产，是一条行之有效的途径。 次生代谢物的研究和组织培养方面，进行工作最多的是联邦德国和***。用组织培养可以生产的化合物有强心苷、吲哚生物碱、黄连素、辅酶Q10等，现已选出高产的细胞系，大规模生产亦有成效。人参为我国名贵药材，现今因野生资源缺少，多用人工栽培，但人参生长慢，6年才有10克左右的人参根（干重），采用组织培养方法可比天然生长速度提高上百倍左右。我国科学家罗士韦早在1963年就成功地培育了人参的组织，但此工作后被迫中断。近年来，南京药学院丁家宜利用组织培养生产出人参干粉。在组织培养中生长速度为0.5克o升-1o日-1(干重)，比栽培人参0.004.5克o日-1o根-1约高100倍以上，并可在20天左右周期内有10-20升大瓶中进行小批量生产，每升得13.9克，其药用成分和药理活性与商品人参相似或更优，现已投入中试生产。这是我国第一个用组织培养进行药的工业化生产的例子（见南京药学院学报，2期，61-76页，1981年）。 在这方面尚待解决的问题是：（1）选出的细胞系中次生物质的产量是否高于起源植物；（2）继代培养后生物合成能力是否能保持；（3）生长是否快速；（4）成材一核算问题。 （四）培养物质温贮藏和种质库的建立 在液氮（-196℃）条件下，加入冷冻保护剂，可使组织培养物的代谢水平降低，有利于细胞、胚状体、试管苗、愈伤组织等的长期保存。据报导，冷冻保存的胡萝卜胚状体，在保存1年后仍有再生成植株的能力，有些国家已利用此方法建立了种质库，但我国在这方面仍是空白。 在国际上一个新的动向是"人工种子"的试验。所谓"人工种子"，是指以胚状体为材料，经过人工薄膜包装的种子。在适宜条件下它萌发长成幼苗。据美国遗传公司报道，美国科学家已成功地把芹菜，苜蓿，花椰菜的胚状体包装成人工种子，并得到较高的萌发率，这些人工种子已生产并投放市场。我国科学工作者成功地研制成水稻人工种子。可见，组织培养将在遗传育种、作物改良和改革作物栽培中获得更大的成效。1、MS培养基配方表中Na2Mo4·2H2O的量是0.025mg/L，在查阅大量资料的基础上，认为此处应该改为0.25mg/L。2、在外植体的消毒方法中，教材中是70%的乙醇浸泡10分钟，然后在5%的次氯酸钠溶液中浸泡5分钟，再在另一5%的次氯酸钠溶液中浸泡5分钟，最后在超净台中用无菌水清洗。按照教材中做法，幼嫩的菊花茎段在消毒液中将全部变黑，无法进行下一步的培养。我们采用70%的乙醇浸泡1分钟，然后在5%的次氯酸钠溶液中浸泡30秒，再在另一5%的次氯酸钠溶液中浸泡30秒，最后在超净台中用无菌水清洗，效果良好。（外植体先在温室内培养了两周）3、教材中外植体的取材是带叶片的茎段，在发芽培养基中培养是很容易从叶芽处萌发新苗，但这种方式与花卉生产中的扦插一样，不会产生书中所说的丛状苗，如不经过多次继代培养,是不能达到扩大繁殖的效果。如果要通过脱分化产生愈伤组织和再分化萌发出丛状苗，达到扩大培养的效果。通过实验证明，选材上，用菊花茎段（不带腋芽）、叶片、叶柄都可以，形成愈伤组织后就会产生丛状苗，当嫩茎长到1.5—2 cm高时将其剪下，转到生根培养基中培养生根。几个做法:1、MS培养基的配制：如果按教材中MS培养基配方表去配制，实验技术要求很高，既要耗费大量时间， 而且微量元素和有机成分易造成浪费，还必需要用到分析天平。建议购买已经配制好的（粉末状）MS培养基，使用起来方便快捷，而且经济实惠。（每瓶500g/80元，可配12L 左右）2、在普通书架的每层顶板下安装1-2个40W的日光灯，就可做成简易的光照培养架。如果空气干燥，可在周边放一些水盆，以提高空气湿度。