水稻秸秆降解放线菌的分离鉴定及其降解机理研究

【摘要】：我国水稻秸秆资源十分丰富,利用微生物使其降解转化为饲料、能源和化工原料对于解决目前面临的环境污染和能源危机具有重大现实意义。 在黑龙江省3个水稻主产区采集27份土壤样品,通过刚果红染色平板初筛;液体摇瓶发酵纤维素酶活测定;水稻秸秆失重率测定;半纤维素和木质素酶活性检测等多重筛选,得到一株高产纤维素酶、对水稻秸秆有较好降解效果的放线菌菌株C-5,该菌株同时具有多种木质纤维素酶活性。通过对该菌株的形态特征、培养特征和生理生化特征观察;16S rDNA序列测定及系统发育分析,将菌株C-5鉴定为灰略红链霉菌(Streptomyces griseorubens)。 测定了灰略红链霉菌C-5对水稻秸秆降解过程中,水稻秸秆主要成分含量的变化和纤维素酶活、半纤维素酶活的连续变化。发酵后,水稻秸秆细胞壁的主要成分得到了有效降解,粗纤维含量明显降低;纤维素、半纤维素酶活均可以在大部分发酵时间内保持在相对较高水平。 采用红外光谱(FTIR)法研究灰略红链霉菌C-5对水稻秸秆的生物降解过程,分析表明,水稻秸秆中含有碳水化合物、木质素和有机硅化物等成分,降解后生成了碳酸盐、硅酸盐和多糖类物质;羧基在发酵过程中以羧酸盐形式存在,一些无机阳离子形成碳酸盐。 对水稻秸秆木质素生物降解过程的红外光谱分析表明,灰略红链霉菌C-5对水稻秸秆木质素的降解主要是氧化作用,发生在木质素单元结构侧链Cα的氧化及Cα-Cβ键的氧化断裂;脂肪醚键发生断裂,苯环侧链的短链脂肪烃被降解;甲氧基含量明显增加,氢醌类物质形成;愈疮木基型木质素的降解程度高于紫丁香基型木质素的降解程度。 利用扫描电镜观察水稻秸秆生物降解过程中的组织结构变化,观察结果表明,在生物降解初期,菌丝通过水稻秸秆端部侵入内部,并在薄壁细胞的腔内繁殖,薄壁细胞开始分解,蜡质-硅化层明显变薄;当菌体大量繁殖后,维管束组织和部分厚壁组织开始降解;降解试验结束时,水稻秸秆的完整结构被严重破坏,薄壁组织被全部降解,蜡质-硅化层大部分也被降解破坏,只剩下部分高度木质化的表皮组织。 研究了不同培养条件对灰略红链霉菌C-5产纤维素酶的影响。结果表明,碳源浓度、氮源浓度、pH和培养温度对CMCase活力的影响均为极显著,碳源浓度是影响CMCase活力的关键性因子;较高浓度的碳源对合成纤维素酶更为有利,外加有机氮源豆饼粉对产纤维素酶的促进作用相对较大,较低浓度的氮源比较高浓度的氮源更能促进纤维素酶的合成;31℃和pH7.5是产酶最佳温度与酸碱度;菌株C-5在最佳产酶条件下的最佳产酶时间为发酵的4~14天。 【关键词】：灰略红链霉菌 筛选 水稻秸秆 生物降解 化学结构性质 显微结构
【学位授予单位】：哈尔滨工业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：S141.4
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-13
• 第1章 绪论13-33
• 1.1 研究目的与意义13-14
• 1.2 国内外研究综述14-31
• 1.2.1 水稻秸秆的资源情况14
• 1.2.2 水稻秸秆的利用现状14-16
• 1.2.3 水稻秸秆的化学组成16-22
• 1.2.4 水稻秸秆生物降解研究进展22-29
• 1.2.5 放线菌降解木质纤维素的研究29-31
• 1.3 存在的问题31-32
• 1.4 课题来源及主要研究内容32-33
• 1.4.1 课题来源32
• 1.4.2 主要研究内容32-33
• 第2章 材料与方法33-48
• 2.1 实验材料33-37
• 2.1.1 土壤样品33
• 2.1.2 秸秆来源33
• 2.1.3 培养基33-35
• 2.1.4 实验试剂35-36
• 2.1.5 试剂配制36-37
• 2.1.6 实验主要仪器37
• 2.2 实验方法37-48
• 2.2.1 水稻秸秆降解菌的分离筛选37-38
• 2.2.2 菌株鉴定38-42
• 2.2.3 纤维素酶活测定42-43
• 2.2.4 水稻秸秆固体发酵试验43
• 2.2.5 水稻秸秆主要组成成分降解率的测定43-44
• 2.2.6 木聚糖酶活测定44-45
• 2.2.7 蒽酮－硫酸法测定总糖45
• 2.2.8 水稻秸秆中木质素的提取45
• 2.2.9 红外光谱分析45
• 2.2.10 电镜观察45-46
• 2.2.11 产纤维素酶条件研究46-47
• 2.2.12 统计分析方法47-48
• 第3章 水稻秸秆降解放线菌的分离鉴定及生物信息学初步分析48-63
• 3.1 菌株的分离筛选48-55
• 3.1.1 菌株的分离和初筛48-50
• 3.1.2 摇瓶发酵筛选50-53
• 3.1.3 水稻秸秆失重率的测定53
• 3.1.4 半纤维素酶和木质素酶活性检测53-55
• 3.2 菌株的鉴定和生物信息学初步分析55-60
• 3.2.1 形态特征55
• 3.2.2 培养特性55-56
• 3.2.3 生理生化特征56-57
• 3.2.4 16S rDNA 序列测定及其生物信息学初步分析57-59
• 3.2.5 菌株C-5 鉴定结果59-60
• 3.3 关于水稻秸秆降解菌筛选和鉴定结果分析60-62
• 3.3.1 对水稻秸秆降解菌筛选结果的分析60-61
• 3.3.2 灰略红链霉菌C-5 的获得61
• 3.3.3 分子分类在放线菌多相分类中的应用61-62
• 3.4 本章小结62-63
• 第4章 灰略红链霉菌C-5 降解水稻秸秆过程分析63-96
• 4.1 水稻秸秆生物降解过程的化学分析63-69
• 4.1.1 水稻秸秆主要成分含量的变化64-66
• 4.1.2 纤维素酶、半纤维素酶酶活的变化66-68
• 4.1.3 产糖含量的变化68-69
• 4.2 水稻秸秆生物降解过程的物理学分析69-83
• 4.2.1 发酵过程中水稻秸秆红外光谱变化69-73
• 4.2.2 水稻秸秆降解过程的扫描电镜观察73-83
• 4.3 灰略红链霉菌C-5 产纤维素酶条件研究83-92
• 4.3.1 碳源浓度对产酶的影响83-84
• 4.3.2 氮源对产酶的影响84-85
• 4.3.3 氮源浓度对产酶的影响85-86
• 4.3.4 pH 对产酶的影响86-87
• 4.3.5 培养温度对产酶的影响87-88
• 4.3.6 产酶条件正交优化试验88-91
• 4.3.7 培养时间对产酶的影响91-92
• 4.4 对灰略红链霉菌C-5 降解水稻秸秆过程及产纤维素酶条件分析92-95
• 4.4.1 关于水稻秸秆降解过程的化学分析92-94
• 4.4.2 关于产纤维素酶条件的分析94-95
• 4.5 本章小结95-96
• 第5章 灰略红链霉菌C-5 降解水稻秸秆机理研究96-104
• 5.1 灰略红链霉菌C-5 对水稻秸秆木质素的降解机理研究96-98
• 5.2 水稻秸秆木质素生物降解机理的红外光谱分析98-100
• 5.3 对水稻秸秆生物降解机理的扫描电镜分析100-102
• 5.4 灰略红链霉菌C-5 对水稻秸秆降解代谢规律102-103
• 5.5 本章小结103-104
• 结论104-106
• 参考文献106-119
• 攻读博士学位期间发表的论文119-121
• 致谢121-122
• 个人简历122

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