秸秆原位降解菌选育与应用及其土壤菌群分子多态性变化

【摘要】：本文利用人工和天然纤维素、半纤维素作为底物，建立了秸秆原位降解菌复式筛选模型，该法在兼顾微生物自然生态类群的同时，能够快速有效地从大量样品中筛选优良的秸秆降解菌。通过复式筛选模型分别从采自江苏省农科院腐烂稻秸样品中分离得到菌株J-1211、J-1212；紫金山森林腐烂落叶样品中分离得到菌株HA-2、HC-6。 根据个体形态、培养特征(群体形态)和生理生化的试验结果，参照《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠，2001)，J-1211、J-1212、HA-2和HC-6初步鉴定属于类芽孢杆菌属(Paenibacillus．spp)。供试菌株16s rDNA V3可变区的变性梯度凝胶电泳结果显示：J-1211、J-1212、HA-2和HC-6图谱不同，说明供试菌株属于不同种。 J-1211、J-1212、HA-2和HC-6耐碱性，pH生长上限大于12；盐度的耐受性大于5％；对常见的重金属、农药和除草剂的抗性较强，这些特性有利于菌株在不同性质农田定殖。植物安全性试验发现J-1211、J-1212、HA-2和HC-6发酵液对水稻、辣椒和棉花没有致病能力，供试植株生长良好，无病征出现。供试菌株对黄单胞菌(Xanthomonas oryzae)、小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)、棉花枯萎病菌(Fusatium moniliforme)有营养物竞争抑制作用。 J-1211、J-1212、HA-2和HC-6的酶学特性研究结果显示：HC-6和J-1211的内切β-1，4-葡聚糖水解酶耐碱能力强，HC-6在pH11.40时保持最大酶反应活力的61.2％；J-1211在pH11.40时保持最大酶反应活力的43.2％；J-1212的内切-β-1，4-葡聚糖水解酶活力50℃仍保持最大酶反应活力的89.2％。淀粉酶活力试验结果显示：HC-6、J-1212、J-1211和HA-2的淀粉酶活力依次为21.6Uml~(-1)、18.6Uml~(-1)、13.1Uml~(-1)和7.11Uml~(-1) J-1211、J-1212、HA-2和HC-6的果胶酶活力分别为23.05Uml~(-1)、21.48Uml~(-1)、21.13Uml~(-1)和21.05Uml~(-1)。 通过单因子试验和多因子试验，确定J-1211发酵培养基为：淀粉0.8％、蔗糖0.2％、硝酸钠1.5％、酵母膏2.5％、氯化钠0.1％、磷酸氢二钾0.1％、氯化钙0.01％、硫酸镁0.03％、三氯化铁0.001％、水1000ml，28℃、起始pH8.5；J-1212发酵培养基为：淀粉0.8％、蔗糖0.2％、硝酸钠0.5％、酵母膏2.5％、氯化钠0.1％、磷酸氢二钾0.1％、氯化钙0.01％、硫酸镁0.03％、三氯化铁0.001％、水1000ml，28℃、起始pH8.0；HA-2发酵培养基为：糊精0.5％、葡萄糖0.5％、亚硝酸钠1.5％、；硫酸铵1.5％、氯化钠0.1％、磷酸氢二钾0.1％、氯化钙0.01％、硫酸镁0.03％、三氯化铁0.001％、水1000ml，37℃、起始pH7.5；HC-6发酵培养基为：糊精0.5％、 葡萄糖0.8%、亚稍酸钠1.5%、;硫酸按1.5%、氛化钠0.1%、磷酸氮二钾0.1%、 氛化钙0.01%、硫酸镁0.03%、三氯化铁0.001%、水1000ml，37”C、起始pH7.5。 菌株最佳组合方式试验结果显示:J一1 211、J一1212、HA一2和HC一6等比例混合后 对水稻秸秆的降解效果最好，5天秸秆粗纤维素降解率为88.3%，J一1211、J一1212、 HA一2和HC一6组合称为JM桔秆原位降解菌剂;JM菌剂与两种同类菌剂(均为日本引 进)降解效果比较发现:盆栽试验中，JM菌剂对稻桔纤维素降解率高达8 7.57%，稻 秸颜色变黑，植物组织明显腐烂，效果显著优于对照菌剂。 秸秆原位降解动态变化研究发现:水稻土含水量40%~60%时，秸秆在20一28℃ 腐解程度大于一2一10℃时的腐解程度，这是因为在20一28℃条件下微生物活动旺盛， 因此在土壤含水量适宜的条件下，温度是影响桔秆腐解的最重要因素;但淹水条件下， 温度不是稻桔腐解的决定因素，土壤通气性差抑制菌剂功能发挥，影响秸秆腐解。在 培养期内，JM菌剂加快稻秸腐解速度，使培养期内土壤速效K和速效P含量迅速提高。 使用JM菌剂的处理在含水量40%~60%的培养条件下，水稻土速效K和速效P分别 最大可提高55.1%和9.27倍;红壤速效K和速效P分别最大可提高1.27倍和92.6 %。淹水时，水稻土速效K和速效P分别最大可提高84.9%和2.77倍;红壤速效K 和速效P分别最大可提高58.8%和31.2%。 模拟试验中，JM菌剂可以提高水稻土和红壤转化酶、纤维素酶活力，20一28℃培 养温度则更有利于转化酶和纤维素酶活力的提高;红壤和水稻土持水量40%一60%时， 稻秸刺激多酚氧化酶和脉酶活力的上升。田间试验数据显示:JM菌剂也可以提高土壤 转化酶活性，在培养期末时达到4.47Ug一，;纤维素酶活力则提高约5倍。 模拟稻秸原位还田条件，分别在水稻土和红壤中添加水稻稻桔培养7叼，第0，5， 25，45，7叼采集土样。采用土壤直接裂解法提取水稻土和红壤细菌总DNA，水稻土 细菌总DNA经过二次纯化;红壤细菌总DNA经过一次纯化后，PCR扩增土壤细菌1 65 rDNAV3可变区，均可获得清晰的目的条带，说明两步纯化法纯化土壤细菌总洲A是 可行的。PCR扩增产物的DGGE分析结果显示:有JM菌剂的水稻土或红壤样品的DGCE 条带增加，说明JM菌剂能够刺激土壤细菌群落分子多态性的增加，随着培养期的延 长，有JM菌剂的处理中细菌群落多态性的变化比空白土壤或无菌剂的处理中的群落 变化要丰富;同时还发现桔秆刺激下不同土壤细菌群落多态性高峰期出现的时间是不 同的。 关健词:秸秆原位还田秸秆动态变化土壤酶菌群分子? 【关键词】：秸秆原位还田 秸秆 动态变化 土壤酶 菌群分子多态性 变性凝胶梯度电泳
【学位授予单位】：南京农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2004
【分类号】：S154.3
【目录】：

• 第一章 文献综述15-36
• 第一节 农作物秸秆的利用15-19
• 一 农作物秸秆利用现状、应用前景和存在问题16-17
• 二 农作物秸秆还田现状17-19
• 第二节 秸秆还田研究进展19-23
• 一 影响秸秆腐解因素方面的研究19-20
• 二 秸秆有机物对土壤物理化学特性的影响20-21
• 三 施用秸秆对作物生长和产量的影响21-22
• 四 秸秆还田对土壤结构的影响22
• 五 秸秆还田对土壤微生物的影响22-23
• 六 秸秆还田产生的有机酸类物质23
• 第三节 秸秆降解生物学机理23-27
• 一 秸秆的组成成分23-24
• 二 秸秆降解的微生物学和酶学机理24-27
• 第四节 秸秆腐解与土壤酶动态的研究方法27-35
• 一 土壤酶学对秸秆腐解的研究进展27-30
• 二 微生物群落多样性研究30-35
• 第五节 研究目的及意义35-36
• 第二章 秸秆降解菌复式筛选模型的建立36-44
• 1 材料与方法36-38
• 2 结果与分析38-41
• 2．1 秸秆降解菌富集及初筛结果38
• 2．2 秸秆降解菌复筛结果38-40
• 2．3 秸秆降解菌三筛结果40-41
• 3 讨论41
• 4 结论41-44
• 第三章 供试菌株鉴定和特殊应用性研究44-61
• 第一节 供试菌株的初步鉴定44-49
• 1 材料44-45
• 2 方法45-46
• 3 结果与分析46-49
• 3．1 不同培养基上的菌落形态46-47
• 3．2 供试菌株菌体形态47-48
• 3．3 供试菌株的生理生化特征48-49
• 4 讨论49
• 5 结论49
• 第二节 供试菌株的特殊应用性研究49-52
• 1 材料49-50
• 2 方法50
• 3 结果与分析50-51
• 3．1 供试菌株对抗生素抗性结果50
• 3．2 供试菌株重金属抗性试验结果50-51
• 3．3 供试菌株农药和除草剂抗性结果51
• 4 讨论51-52
• 5 结论52
• 第三节 供试菌株的酶学特征初探52-57
• 1 材料方法52-53
• 2 结果与分析53-56
• 2．1 pH对内切-β-1，4-葡萄糖聚糖水解酶活力影响53-54
• 2．2 不同温度对内切β-1，4-葡萄糖聚糖水解酶活力影响54
• 2．3 供试菌株其它酶类的定性试验54-55
• 2．4 供试菌株微晶纤维素酶活力试验结果55
• 2．5 供试菌株淀粉酶活力试验结果55-56
• 2．6 供试菌株果胶酶活力试验结果56
• 3 讨论56-57
• 4 结论57
• 第四节 供试菌株的生物安全性试验57-61
• 1 材料与方法57-58
• 2 结果与分析58-60
• 2．1 供试菌株与植物病害的关系58
• 2．2 J-1211发酵液对水稻、辣椒和棉花的感染试验58-59
• 2．3 J-1212发酵液对水稻、辣椒和棉花的感染试验59
• 2．4 HA-2发酵液对水稻、辣椒和棉花的感染试验59
• 2．5 HC-6发酵液对水稻、辣椒和棉花的感染试验59-60
• 3 讨论60
• 4 结论60-61
• 第四章 秸秆原位降解菌降解效果研究61-70
• 第一节 不同菌株组合方式对秸秆降解效果的影响61-63
• 1 材料与方法61
• 2 结果与分析61-62
• 2．1 最佳组合方式的确定61-62
• 3 讨论与结论62-63
• 第二节 JM菌剂降解效果的评价63-70
• 1 材料与方法63-65
• 2 结果与分析65-68
• 2．1 实验室条件下秸秆原位降解菌剂降解能力测定65
• 2．2 供试土壤主要重金属离子原子吸收分析65-66
• 2．3 Cd~(2+)污染土壤中菌剂秸秆降解效果比较66-67
• 2．4 盆栽试验供试菌株的检出率67-68
• 3 讨论68-69
• 4 结论69-70
• 第五章 JM菌群的发酵条件优化与小试生产70-82
• 1 材料与方法70-72
• 2 结果与分析72-80
• 2．1 供试菌株生长曲线的测定结果72
• 2．2 碳源对液体发酵时菌体数量的影响72-73
• 2．3 氮源对液体发酵时菌体数量的影响73-74
• 2．4 氯化钠浓度对液体发酵时菌体数量的影响74-75
• 2．5 碳氮比对液体发酵时菌体数量的影响75
• 2．6 通气量对液体发酵时菌体数量的影响75-76
• 2．7 pH对菌株液体发酵时菌体数量的影响76-78
• 2．8 温度对液体发酵时菌体数量的影响78
• 2．9 多因子发酵条件试验结果78-79
• 2．10 小试发酵试验结果79-80
• 3 讨论80
• 4 结论80-82
• 第六章 稻秸原位降解过程的动态研究82-117
• 第一节 不同条件下秸秆原位降解的动态变化82-90
• 1 材料与方法82-83
• 2 结果与分析83-89
• 2．1 秸秆纤维素含量测定结果83-86
• 2．2 秸秆半纤维素含量测定结果86-89
• 3 讨论89
• 4 结论89-90
• 第二节 JM菌剂降解秸秆对土壤理化性质的影响90-103
• 1 材料与方法90-91
• 2 结果与分析91-102
• 2．1 土壤pH值的动态变化91-94
• 2．2 土壤有机质的动态变化94-96
• 2．3 土壤速效钾的动态变化96-99
• 2．4 土壤速效磷的动态变化99-102
• 3 讨论102-103
• 4 结论103
• 第三节 秸秆降解对土壤酶活性动态变化的影响103-117
• 1 材料与方法103-106
• 2 结果与分析106-115
• 2．1 土壤转化酶的动态变化106-108
• 2．2 土壤纤维素酶的动态变化108-110
• 2．3 土壤多酚氧化酶的动态变化110-112
• 2．4 土壤脲酶的动态变化112-114
• 2．5 田间试验土壤酶活力变化114-115
• 3 讨论115
• 4 结论115-117
• 第七章 稻秸对土壤菌群分子多态性变化的影响117-128
• 1 材料与方法117-120
• 2 结果与分析120-125
• 2．1 两种土壤细菌总DNA的提取和纯化120-122
• 2．2 土壤细菌16S rDNA V3区扩增122-123
• 2．3 变性梯度凝胶电泳分离扩增V3片断123-125
• 3 讨论125-127
• 4 结论127-128
• 全文讨论128-131
• 全文总结131-134
• 参考文献134-147
• 附表147-148
• 致谢148

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