秸秆纤维素高效降解真菌的筛选、鉴定及其纤维素酶基因克隆

【摘要】： 我国每年的作物秸秆产出量约6.5亿吨,折合纤维素含量约2亿多吨,是自然界藴藏最丰富的可再生资源。但是作物秸秆由于组成成分结构的复杂性,不易降解已经成为生产中的障碍,特别在以种植业为主的地区,秸秆在短期内的不易腐解,加上直接还田影响墒情和耕作,导致废弃和焚烧秸秆遍及广大农村,由此引起环境污染和严重的资源浪费,获取高效降秸秆纤维素的微生物菌株及其制剂的应用是解决我国严峻秸秆问题技术的关键。本文进行了秸秆降解微生物的研究,取得了以下主要结果: 利用稀释涂平板法从300个来自吉林,浙江,四川,河北,北京等地的土壤样品中初筛到360株秸秆纤维素降解菌,依据降解菌在平板上降解圈的大小,得到5株降解能力较强的真菌,分别命名为T1,HD5,HD6,HD7和HD24。这5株真菌均能以秸秆纤维素为唯一碳源良好生长。通过形态观察、18S rDNA序列分析和ITS序列分析鉴定这5株菌分别属于肉座菌属的Hypocrea lixii(Trichoderma harzianum)、曲霉属的黄曲霉(Aspergillus flavus)、曲霉属的烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、木霉属的Trichoderma koningiopsis和青霉属的草酸青霉(Penicillium oxalicum)。 纤维素降解菌株Hypocrea lixiiT1,Aspergillus flavus HD5,Aspergillus fumigatus HD6,Trichoderma koningiopsisHD7和Penicillium oxalicum HD24在固体平板上和液体培养基中都有很好的降解效果。在固体平板上,秸秆纤维素的添加量为1%时,Hypocrea lixiiT1,Aspergillus flavus HD5,Aspergillus fumigatus HD6,Trichoderma koningiopsisHD7和Penicillium oxalicum HD24 30℃培养7d,固体平板中央出现明显的降解透明圈,为20-25mm不等。在液体培养基中,Hypocrea lixii T1,Aspergillus flavus HD5,Aspergillus fumigatus HD6,Trichoderma koningiopsis HD7和Penicillium oxalicum HD24在第3d全酶活(FPA)均达到最大,其FPA的最大酶活力分别为25.4U,34.36U,28.85U,31.19U,32.05U,比标准菌株Trichoderma viride(AS3.3711)的酶活力分别高出21.88%,64.87%,38.43%,49.66%,53.79%。它们的最适反应温度均为50℃,但是菌株间产酶的pH值存在差异,菌株T1,HD5,HD6的最适pH值为5,菌株HD7的最适pH值为5.5,而菌株HD24的最适pH值为6。 不同的氮源及其用量影响菌株降解纤维素的FPA活性,确定了菌株最佳的氮源种类及其用量:Hypocrea lixiiT1的最佳氮源为NaNO_3,添加量为1.5%;Aspergillus flavus HD5的最佳氮源为(NH_4)_2SO_4,添加量为2%;Aspergillus fumigatus HD6的最佳氮源为(NH_4)_2SO_4,添加量为0.5%;Trichoderma koningiopsisHD7的最佳氮源为(NH_4)_2SO_4,添加量为1.5%;Penicillium oxalicumHD24的最佳氮源为(NH_2)_2CO添加量为1%。 添加0.1%蔗糖对菌株降解纤维素的FPA活性均呈现抑制作用,而添加0.1%的纤维二糖只对Hypocrea lixiiT1,Aspergillus flavus HD5,Aspergillus fumigatus HD6,Trichoderma koningiopsisHD7的FPA活性表现了一定的抑制效应,明显提高Penicillium oxalicumHD24的FPA活性;添加0.1%的Tween 20对Hypocrea lixiiT1, Aspergillus fumigatus HD6和Trichoderma koningiopsisHD7的FPA活性促进作用不明显,但显著提高了Aspergillus flavus HD5和Penicillium oxalicumHD24的FPA活性。 利用SMART cDNA library Construction技术,构建了Hypocrea lixii T1,Aspergillus fumigatus HD6和Trichoderma koningiopsis HD7的cDNA文库:通过抽提总RNA,经反转录合成cDNA第一链,PCR合成第二链,制备了cDNA的全长片段,收集500bp以上的片段,与λTriplE载体重组,其库容量均达到10~9pfu/mL,重组载体经体外包装、转染E. coli LE392,在Amp+的抗性培养基上获得10万多个λ噬菌斑。利用纤维素底物诱导,筛选到了携带纤维素外切酶和内切酶基因的目的克隆子320个,挑选其中45个阳性克隆子,经PCR扩增测序和比对,获得3个新的纤维素酶基因。 采用双向凝胶电泳(2DE)技术,研究了在相同培养条件下Trichoderma viride AS3.3711,Aspergillus fumigatus HD6,Trichoderma koningiopsisHD7和Penicillium oxalicum HD24的蛋白组学,结果表明纤维素酶的活性与其蛋白质的表达密切相关,这些菌株的2DE图谱之间也存在明显的差异,推测这些差异表达的蛋白质点可能与纤维素酶的种类、活性有关。 【关键词】：秸秆纤维素 微生物降解 纤维素酶 cDNA文库 蛋白质组学
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：S141.4
【目录】：

• 摘要6-8
• Abstract8-14
• 第一章 纤维素和纤维素酶的研究进展14-31
• 1.1 秸秆纤维素资源及其性质14-18
• 1.1.1 丰富的秸秆纤维素资源14-15
• 1.1.2 秸秆纤维素的组成15-17
• 1.1.3 秸秆纤维素的性质17-18
• 1.2 降解纤维素的微生物18-19
• 1.2.1 真菌类型18-19
• 1.2.2 细菌类型19
• 1.2.3 放线菌类型19
• 1.3 纤维素酶的研究进展19-26
• 1.3.1 纤维素降解酶系19-22
• 1.3.2 纤维素酶的结构分类22-23
• 1.3.3 纤维素酶的作用机理23-25
• 1.3.4 纤维素酶基因的克隆及表达25-26
• 1.4 纤维素酶蛋白质组学研究进展26-27
• 1.4.1 蛋白质组学研究的历史背景26
• 1.4.2 微生物蛋白质组学研究的内容和方法26-27
• 1.4.3 纤维素酶领域的蛋白质组学研究进展27
• 1.5 秸秆纤维素的应用27-29
• 1.5.1 秸秆还田27-28
• 1.5.2 饲用化28
• 1.5.3 制备复合材料28
• 1.5.4 生物炼制28-29
• 1.6 研究的目的和意义29
• 1.7 研究内容、方法和技术路线29-31
• 1.7.1 本论文研究的内容和方法29-30
• 1.7.2 本论文研究的技术路线30-31
• 第二章 秸秆纤维素降解菌的筛选31-42
• 2.1 实验材料31-32
• 2.1.1 样品来源31
• 2.1.2 碳源及培养基31-32
• 2.1.3 主要试剂32
• 2.1.4 主要仪器32
• 2.2 实验方法32-36
• 2.2.1 筛选方法32
• 2.2.2 表型特征鉴定32-33
• 2.2.3 18S rDNA 鉴定33-34
• 2.2.4 18S rDNA-5.8Sr DNA-28Sr DNA ITS 序列鉴定34-35
• 2.2.5 18S rDNA 系统发育树的构建35
• 2.2.6 ITS 序列系统发育树的构建35-36
• 2.3 结果与分析36-41
• 2.3.1 秸秆纤维素降解菌的筛选36-37
• 2.3.2 分离菌株的生长特性37
• 2.3.3 分离菌株的形态观察37
• 2.3.4 分离菌株的18S rDNA 序列分析37-38
• 2.3.5 基于18S rDNA 的系统发育树的构建38-39
• 2.3.6 基于ITS 序列的系统发育树的构建39-41
• 2.4 讨论41-42
• 第三章 秸秆纤维素降解菌液体培养产酶及其影响因素的研究42-52
• 3.1 实验材料42-43
• 3.1.1 实验菌株和培养基42
• 3.1.2 药品、试剂42
• 3.1.3 溶液和缓冲液42-43
• 3.1.4 主要仪器43
• 3.2 实验方法43-46
• 3.2.1 纤维素粗酶液的制备43
• 3.2.2 纤维素酶活力的测定43-44
• 3.2.3 葡萄糖标准曲线的绘制44
• 3.2.4 不同时间（day）对降解菌株酶活力的影响44
• 3.2.5 pH 对降解菌株酶活力的影响44-45
• 3.2.6 温度对降解菌株酶活力的影响45
• 3.2.7 氮源对降解菌株酶活力的影响45
• 3.2.8 碳源对降解菌株酶活力的影响45-46
• 3.3 结果分析46-51
• 3.2.1 培养时间（day）对降解菌株酶活力的影响46-48
• 3.2.2 pH 值对降解菌株酶活性的影响48
• 3.2.3 温度对降解菌株作用效果的影响48-49
• 3.2.4 氮源对降解菌株作用效果的影响49-50
• 3.2.5 碳源对降解菌株作用效果的影响50-51
• 3.4 讨论51-52
• 第四章 纤维素降解菌 cDNA 文库的构建和纤维素酶基因的克隆52-63
• 4.1 实验材料52-53
• 4.1.1 菌株与λ噬菌体52
• 4.1.2 培养基和抗生素52
• 4.1.3 溶液、缓冲液和试剂52-53
• 4.1.4 RNA 提取准备工作53
• 4.2 实验方法53-58
• 4.2.1 总RNA 提取53-54
• 4.2.2 cDNA 文库的构建54-57
• 4.2.3 目的克隆子的筛选57-58
• 4.3 结果与分析58-62
• 4.3.1 降解菌株总RNA 提取和cDNA 文库构建部分酶切片段的制备58
• 4.3.2 降解菌株cDNA 文库的库容量58-59
• 4.3.3 携带纤维素酶基因的克隆子的筛选59-62
• 4.4 讨论62-63
• 第五章 纤维素分解菌株的蛋白质组学研究63-70
• 5.1 实验材料63-65
• 5.1.1 实验菌株与培养基63
• 5.1.2 药品、试剂63
• 5.1.3 溶液及配置63-65
• 5.1.4 实验仪器65
• 5.2 实验方法65-67
• 5.2.1 蛋白质的提取65
• 5.2.2 Bradford 法对蛋白质的定量65-66
• 5.2.3 蛋白质的双向凝胶电泳66-67
• 5.2.4 蛋白质凝胶扫描和图像分析67
• 5.3 结果与分析67-69
• 5.3.1 样品中蛋白质的含量67-68
• 5.3.2 各菌株蛋白质表达图谱分析68-69
• 5.3.3 各菌株蛋白质差异表达69
• 5.4 讨论69-70
• 第六章 全文结论70-72
• 6.1 结论70-71
• 6.2 下一步拟开展的工作71-72
• 参考文献72-83
• 致谢83-84
• 作者简历84

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