降解木质素厌氧菌株筛选及其转化秸秆作用研究

【摘要】：秸秆作为可再生资源具有巨大的潜在价值，因其结构复杂自然条件下无法被有效利用，如何有效综合利用秸秆资源已成为各国亟待解决的问题。 生物法降解有其独特的优势被人们广泛采用，目前研究较多的木质素降解菌是白腐真菌，并对其所产的三种木质素降解酶作了大量研究。然而白腐真菌发酵时间长，生长受环境影响很大，在生产实践中效率并不高。筛选其它高效降解木质素菌株对于秸秆资源有效利用具有重要意义。 瘤胃是天然生物反应器，瘤胃微生物能够降解木质纤维素类物质，其中必存在具有降解木质素潜力的菌种。本文从牛瘤胃液内筛选降解木质素的菌株，通过驯化培养提高其木质素降解率，并选择木质素降解能力强的菌株RB_1、RB_6，研究其酶学性质，优化产木质纤维素降解酶的培养条件，对比研究厌氧菌株及好氧菌株转化秸秆的作用。通过本项研究，得出以下结论： 1.以木质素为唯一碳源，在厌氧条件下从瘤胃液中筛选到降解木质素的厌氧菌株，经过驯化传代培养得到木质素降解率高的目标菌株RB_1、RB_6。通过生理生化分析及分子生物学鉴定，确定菌株RB_1为大肠埃希氏菌株(Escherichia coli)。菌株RB_6为胡萝卜软腐果胶杆菌(Pectobacterium carotovorum)。 2.检测菌株RB_1、RB_6发酵上清液，测定出含一定量的阿魏酸酯酶(Feruloyl esterase,FAE)和乙酰酯酶(Acetyl esterase, AE)。对菌株发酵产酶培养条件进行单因素试验和正交优化试验，得到较高酶活力。实验结论如下：菌株RB_1在最优发酵条件下，FAE活最高可达到2.189mU/mL，AE活力最高可达到610.08mU/mL。菌株RB_6在最佳培养条件下，FAE酶活最高可达到1.822mU/mL，AE活力最高可达到648.22mU/mL。 3.对菌株RB_1、RB_6所产的FAE、AE进行酶学性质研究，结果如下：两菌株RB_1、RB_6的FAE的最适宜作用温度都为40℃，最适pH都在8.0左右，并且在40℃有较好的温度稳定性，pH5.0~8.0范围有很好的pH稳定性。两菌株RB_1、RB_6的AE的最适宜作用温度同样为40℃，pH8.0左右才能保有较高酶活力，酶活稳定的pH范围较窄。10种金属离子对菌株RB_1的FAE、AE的影响结果为: Ni+、Cu~(2+)能够完全抑制FAE活力，Fe~(3+)对FAE促进作用最明显，仅Ca~(2+)对AE都有抑制作用，而Mg~(2+)对AE促进作用最强。10种金属离子对菌株RB_6的FAE、AE的影响结果为: Fe~(2+)对FAE影响最显著，Zn~(2+)可完全抑制FAE，只有Ni~+离子对AE其有促进作用。 4.研究菌种B_7、B_8、B_9、F_3、F_4、F_8、糙皮侧耳以及RB_1、RB_6发酵秸秆的试验表明：从降解水稻秸秆木质素的能力来看，糙皮侧耳的降解能力最强，木质素降解率高达42.33%。厌氧细菌RB_1、RB_6强于好氧细菌B_7、B_8、B_9，弱于真菌F_3、F_4、F_8、糙皮侧耳。从降解玉米秸秆木质素的能力来看，木质素降解率最高属F_3，可达31.35%，而厌氧细菌RB_1、RB_6发酵秸秆的时间远比其他菌株发酵时间短，提高了发酵效率。菌株RB_1、RB_6应用于造纸黑液木质素降解研究表明，其对造纸黑液的木质素也存在一定的降解能力。 【关键词】：木质素 生物降解 阿魏酸酯酶 乙酰酯酶 秸秆
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：X712
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-13
• 第1章 绪论13-21
• 1.1 立题意义13-14
• 1.2 秸秆资源利用的研究现状14-16
• 1.2.1 秸秆利用的现状14
• 1.2.2 秸秆利用的限制因素14-16
• 1.2.3 秸秆的预处理技术16
• 1.3 微生物降解木质素的研究16-19
• 1.3.1 降解木质素的微生物16-17
• 1.3.2 木质素的降解酶17-19
• 1.4 瘤胃微生物降解木质素的研究19-20
• 1.4.1 瘤胃微生物的介绍19
• 1.4.2 瘤胃的多纤维素酶体19-20
• 1.5 研究内容20
• 1.6 研究创新点20-21
• 第2章 降解木质素厌氧细菌的筛选及鉴定21-36
• 2.1 引言21
• 2.2 试验材料21-23
• 2.2.1 主要设备21-22
• 2.2.2 培养基22
• 2.2.3 试剂的配制22-23
• 2.3 试验方案23-25
• 2.3.1 瘤胃液的采集23
• 2.3.2 菌株的筛选纯化23-24
• 2.3.3 菌株的驯化24
• 2.3.4 菌株保藏24
• 2.3.5 生长曲线的绘制24-25
• 2.3.6 菌种鉴定25
• 2.4 结果与分析25-34
• 2.4.1 分离纯化结果26
• 2.4.2 驯化结果26-29
• 2.4.3 菌株生长曲线29-30
• 2.4.4 菌种鉴定30-34
• 2.5 讨论34
• 2.6 小结34-36
• 第3章 菌株的酶学试验研究36-54
• 3.1 引言36
• 3.2 试验材料36-37
• 3.2.1 菌种36
• 3.2.2 主要试剂36-37
• 3.2.3 培养基37
• 3.2.4 试剂的配制37
• 3.3 试验方法37-39
• 3.3.1 漆酶检测法37
• 3.3.2 过氧化物酶检测法37-38
• 3.3.3 粗酶液的制备方法38
• 3.3.4 阿魏酸酯酶(FAE)活性测定方法38
• 3.3.5 乙酰酯酶(AE)活性测定方法38
• 3.3.6 葡糖糖的标准曲线制作方法38-39
• 3.3.7 发酵液还原糖的测定39
• 3.4 试验方案39-40
• 3.4.1 产酶平板显色试验39
• 3.4.2 液体培养测定其还原糖动态变化曲线39
• 3.4.3 检测发酵液阿魏酸酯酶和乙酰酯酶39
• 3.4.4 测定阿魏酸酯酶和乙酰酯酶动态变化曲线39-40
• 3.4.5 酶学性质的研究40
• 3.5 结果与分析40-51
• 3.5.1 产酶平板显色试验结果40
• 3.5.2 发酵液中还原糖动态变化40-42
• 3.5.3 菌株发酵产酶的动态变化曲线42-43
• 3.5.4 阿魏酸酯酶酶学性质研究43-48
• 3.5.5 乙酰酯酶酶学性质研究48-51
• 3.6 讨论51-52
• 3.7 小结52-54
• 第4章 菌株发酵产酶条件的优化试验研究54-67
• 4.1 引言54
• 4.2 试验材料54
• 4.2.1 菌株54
• 4.2.2 培养基54
• 4.3 试验方法54-55
• 4.4 试验方案55
• 4.4.1 单因素试验55
• 4.4.2 正交优化试验55
• 4.5 结果与讨论55-65
• 4.5.1 发酵产 FAE 条件的优化55-58
• 4.5.2 发酵产 AE 条件的优化58-64
• 4.5.3 正交试验结果验证64-65
• 4.6 讨论65
• 4.7 小结65-67
• 第5章 菌株转化秸秆的对比研究及应用67-77
• 5.1 引言67
• 5.2 试验材料67-69
• 5.2.1 菌株67
• 5.2.2 造纸黑液67-68
• 5.2.3 溶液配制68
• 5.2.4 培养基68-69
• 5.3 试验方法69-70
• 5.3.1 秸秆成分分析方法69
• 5.3.2 造纸黑液木素测定69-70
• 5.4 试验方案70
• 5.4.1 不同菌株降解玉米秸秆的对比试验70
• 5.4.2 不同菌株降解水稻秸秆的对比试验70
• 5.4.3 菌株 RB_1、RB_6造纸黑液降解实验70
• 5.5 结果与讨论70-75
• 5.5.1 菌株降解秸秆成分分析70-74
• 5.5.2 菌株 RB_1、RB_6造纸黑液木质素降解实验74-75
• 5.6 讨论75
• 5.7 小结75-77
• 第6章 结论与展望77-80
• 6.1 结论77-79
• 6.1.1 菌株筛选及鉴定77
• 6.1.2 菌株的酶学试验77-78
• 6.1.3 产酶条件优化试验78
• 6.1.4 菌株降解秸秆及应用试验78-79
• 6.2 展望79-80
• 参考文献80-86
• 致谢86

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