凝结芽孢杆菌利用酸爆玉米秸秆酶解液制备L-乳酸的研究

【摘要】：乳酸及其衍生物作为重要的有机化工原料和精细化学品应用广泛，其中将聚乳酸用于制造生物降解材料是最新也是最具有发展潜力的用途之一。目前国内外生产乳酸的主要方法为以淀粉等粮食作物为原料的微生物发酵法。考虑到粮食安全性问题，在我国发展生物质乳酸更具有特殊意义。本文选择酸性蒸汽爆破玉米秸秆渣为原料和嗜热菌株凝结芽孢杆菌S44作为发酵菌株，研究如何高效转化木质纤维原料制备乳酸技术。酸性蒸汽爆破玉米秸秆具有较高的酶解得率，凝结芽孢杆菌作为生物质乳酸发酵菌种，具有高温、厌氧发酵等优点，且L-乳酸光学纯度较高，具有工业化应用前景。研究主要内容和结果如下： 本论文首先建立了HPLC法同时测定生物质乳酸发酵液中的有机酸及糖类的分析方法。使用Bio-Rad Aminex HPX-87H色谱柱，以5mmol/L的H2SO4作为流动相，在柱温55oC，流速0.6mL/min下，采用示差折光检测器进行检测。结果表明，该方法可在17min内实现发酵液中的各种有机酸和糖类等完全分离定量，6种有机酸和3种糖类在0.15-5.19g/L质量浓度范围内的线性关系良好，回归方程的线性相关在0.99997以上。将该法用于米根霉和凝结杆菌发酵液的检测，两个水平的加标回收率为96.91%-103.11%，相对标准偏差(n=6)为0.809%-4.61444%。 通过单因素实验方法和Plackett-Burman实验方法，对嗜热菌株凝结芽孢杆菌S44发酵生产L-乳酸的培养条件及培养基主要因子进行了优化和筛选。确定最优发酵条件为：种子培养时间为12h，发酵起始pH为7.2，发酵温度50℃，培养时摇床的转速为180rpm；发酵培养基根据响应面设计结果求得最佳组合为(g/L)：葡萄糖85，酵母膏干粉2.5，玉米浆干粉1.2，(NH4)2SO43.0， KH2PO40.22，MgSO47H2O0.4，MnSO4H2O0.03，FeSO47H2O0.03，CaCO370。此条件下85g/L葡萄糖发酵72h消耗完毕，乳酸产量由优化前的59.09g/L提高到73.95g/L，比原来提高了25.2%，糖酸转化率为86.75%，糖利用率为100%。 在摇瓶实验基础上进行了7L发酵罐试验，重点考察了发酵pH和补料方式对菌株发酵产乳酸的影响，结果表明发酵过程控制pH为6.3可达到最佳效果，85g/L葡萄糖发酵48h消耗完毕，乳酸浓度达到71g/L、糖酸转化率达到88.75%；起始葡萄糖浓度在高于100g/L的发酵液中存在一定的底物抑制，分批补料可以有效的减少底物抑制，增加发酵的总糖浓度。总糖浓度110g/L的发酵液分两次补料发酵72h L-乳酸浓度达到82g/L，较分批发酵（58g/L）提高41.38%，糖酸转化率达到75.92%。 围绕酸性蒸汽爆破玉米秸秆渣开展了生物质乳酸制备技术的研究。酸性蒸汽爆破玉米秸秆渣主要富含纤维素和木质素，酶解效果良好，当底物浓度为83g纤维素/L，酶用量为15FPU/g纤维素和30CBU/g纤维素，水解48h，葡萄糖得率和纤维素酶酶解得率分别为85.02%、91.14%；添加PEG6000不仅有助于酶解效率的提高，还可降低酶用量33.3%。纤维素酶用量为10FPIU/g纤维素，β-葡萄糖苷酶用量为20CBU/g纤维素，底物浓度为110g纤维素/L的酸性蒸汽爆破玉米秸秆渣在添加0.07g/g纤维素PEG后酶解48h还原糖含量为102.89g/L，可直接用于乳酸发酵。这一结果暗示聚乙二醇辅助酶解还可进一步促进酸性蒸汽爆破玉米秸秆渣高浓度酶解，获得的酶解液省略了糖浓缩环节，有效降低了生产成本。 利用酶解液直接进行乳酸发酵实验发现凝结芽孢杆菌S44可同步利用酸性蒸汽爆破玉米秸秆渣酶解液中的多种糖类物质。摇瓶发酵酶解液72h葡萄糖，纤维二糖和木糖利用率分别为76.23%、91.37%和100%，乳酸浓度达到50.83g/L；7L发酵罐补料发酵实验显示4L酶解液发酵42h，葡萄糖浓度降为1.07g/L、纤维二糖为2.31g/L、木糖为0.17g/L，L-乳酸产量为61.28g/L，补料2倍酶解液0.8L，继续发酵至72h L-乳酸产量为75.03g/L，葡萄糖为8.34g/L，纤维二糖为1.92g/L、木糖为0.16g/L；发酵罐带渣发酵实验显示酸爆玉米秸秆渣酶解48h，葡萄糖浓度达到85.64g/L，在48h接入菌种后发酵72h乳酸浓度达到57.21g/L，葡萄糖的转化率为74.11%。 【关键词】：凝结芽孢杆菌 L-乳酸 酸爆玉米秸秆渣 发酵 酶解
【学位授予单位】：南京林业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：TQ921.3
【目录】：

• 致谢3-4
• 摘要4-6
• Abstract6-12
• 前言12-13
• 1 文献综述13-24
• 1.1 乳酸的性质和应用13
• 1.2 乳酸的生产方法13-16
• 1.2.1 化学合成法14
• 1.2.2 酶法生成乳酸14
• 1.2.3 发酵法14-16
• 1.3 发酵乳酸的微生物16-19
• 1.3.1 传统的菌株筛选和改良17-18
• 1.3.2 基因工程在育种中的应用18-19
• 1.4 木质纤维素发酵制乳酸研究进展19-22
• 1.4.1 木质纤维素原料水解工艺19-20
• 1.4.2 木质纤维素水解液的乳酸发酵20-22
• 1.5 研究的内容、目的与意义22-24
• 2 发酵液中乳酸与糖类同步检测方法的建立24-32
• 2.1 材料与方法24-25
• 2.1.1 仪器与试剂24
• 2.1.2 色谱分离条件24-25
• 2.1.3 标准溶液制备25
• 2.1.4 样品预处理25
• 2.1.5 定性与定量25
• 2.2 结果与讨论25-31
• 2.2.1 标准物质的确定25-26
• 2.2.2 柱温的选择26-27
• 2.2.3 流速的选择27-28
• 2.2.4 标准工作曲线的绘制28-29
• 2.2.5 重复性和回收率试验29-31
• 2.3 本章小结31-32
• 3 凝结芽孢杆菌 S44 摇瓶及发酵罐优化32-53
• 3.1 材料与方法32-34
• 3.1.1 菌株32
• 3.1.2 试剂32
• 3.1.3 主要仪器32-33
• 3.1.4 培养基33
• 3.1.5 培养条件及方法33-34
• 3.1.6 分析检测方法34
• 3.1.6.1 残糖及乳酸的测定34
• 3.1.6.2 糖酸转化率的计算34
• 3.2 结果与讨论34-52
• 3.2.1 发酵种龄的确定34-35
• 3.2.2 发酵培养条件的优化35-38
• 3.2.2.1 起始 pH 值以及 CaCO3对发酵产 L‐乳酸的影响35-37
• 3.2.2.2 不同培养温度对发酵的影响37
• 3.2.2.3 不同转速对发酵的影响37-38
• 3.2.3 摇瓶发酵培养基的优化38-46
• 3.2.3.1 不同起始碳源浓度对发酵产 L‐乳酸的影响38-39
• 3.2.3.2 不同氮源对发酵产 L‐乳酸的影响39-40
• 3.2.3.3 通过响应面试验优化发酵培养基40-46
• 3.2.4 在优化后的培养基条件下发酵历程46-47
• 3.2.5 7L 发酵罐工艺条件的研究47-52
• 3.2.5.1 pH 对发酵的影响47-49
• 3.2.5.2 提高发酵罐发酵的起始糖浓度对发酵的影响49-50
• 3.2.5.3 分批补料对发酵的影响50-52
• 3.3 本章小结52-53
• 4 酸爆玉米秸秆渣酶解及发酵产 L-乳酸的工艺研究53-68
• 4.1 材料与方法53-56
• 4.1.1 原料及其预处理53-54
• 4.1.2 实验仪器54
• 4.1.3 实验所用酶54-55
• 4.1.4 酶解糖化制备木质纤维素水解上清液55
• 4.1.5 发酵罐发酵条件55-56
• 4.1.6 分析方法56
• 4.2 结果与讨论56-66
• 4.2.1 酸爆渣酶解工艺的研究56-63
• 4.2.1.1 纤维素酶酶解酸爆渣历程56-57
• 4.2.1.2 不同分子量 PEG 对木质纤维素水解的影响57-58
• 4.2.1.3 降低反应体系中酶液用量58-59
• 4.2.1.4 不同纤维素浓度对木质纤维素水解的影响59-61
• 4.2.1.5 不同 PEG 浓度对木质纤维素水解的影响61-62
• 4.2.1.6 PEG 加入时机对木质纤维素水解影响62-63
• 4.2.2 木质纤维素酶解上清液摇瓶发酵 L-乳酸63-66
• 4.2.2.1 酶解上清液摇瓶发酵产乳酸性能研究63-64
• 4.2.2.2 酶解上清液发酵罐补料发酵产乳酸性能研究64-65
• 4.2.2.3 发酵罐酶解后直接发酵产乳酸性能研究65-66
• 4.3 本章小结66-68
• 5 结论与展望68-70
• 5.1 结论68-69
• 5.2 展望69-70
• 参考文献70-75
• 攻读硕士期间发表论文75

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