筛选高效半纤维素降解菌及利用秸秆发酵酒精研究

【摘要】：近些年来,由于化石燃料消耗逐渐殆尽,生物乙醇燃料得到了快速的发展。粮食类物质如玉米用于生物乙醇生产给世界粮食供应造成了沉重负担。非粮食物质如木质纤维素被认为是理想的用于生物乙醇生产的底物。生物乙醇生产工业过程获得最大收益的先决条件在于将木质纤维素水解产物中的六碳糖和五碳糖完全和高效的转化为生物乙醇。提高秸秆中的纤维素和半纤维素的利用率,关键是获取高产纤维素酶和半纤维素酶的菌种以及对其发酵工艺研究。 国内外在纤维素酶生产、纤维素转化燃料乙醇的研究方面取得了较大进展,而有关于半纤维素酶、半纤维素转化燃料乙醇的研究相对较少。本课题以筛选高效的半纤维素降解菌为出发点,从水稻田田边腐质土壤、腐烂的竹叶、树叶、牛粪、菜园地旁腐烂草堆、腐质土壤及水稻田内腐烂稻草等样品中经过富集培养和分离纯化,共筛选到半纤维素降解菌42株,其中细菌37株,真菌5株。再根据秸秆降解率和半纤维素酶活测定试验结果,确定FⅢ1、FV3、BV5为研究菌株,进行下一步实验,其中FⅢ1、FV3为真菌,BV5为细菌。经过菌株鉴定,FⅢ1为特异青霉(Penicillium notatum), FV3为扩张青霉(Penicillium expansum), BV5为类芽孢杆菌属(Paenibacillus sp.)。 为确定各菌发酵特性,分别以真菌FV3和FⅢ1为出发菌株,进行固体发酵初始pH值、稻草豆粕比、最适培养温度、固体曲水料比、接种量、固体曲装瓶量、最适发酵时间等单因子优化实验研究,确定最适固体发酵条件。真菌FV3最高酶活达到了7.94 IU/ml,真菌FⅢ最高酶活达到了6.21 IU/ml.发酵液中还原糖含量仍比较低,最高为0.79mg/ml半纤维素酶为多酶体系,因此下一步考虑到进行混菌试验,选取半纤维素降解菌FV3、BV5和实验室已有纤维素降解菌D-7两两组合进行混菌试验。混菌发酵试验结果显示真菌FV3和细菌BV5为最优组合,其糖化条件为：糖化开始时间为96 h、最适糖化温度为50℃、最适糖化时间为72h。发酵液中还原糖含量达到1.48mg/ml,比单菌发酵提高了约80%。固体发酵容器扩大到15L后,还原糖含量达到4.34mg/ml,比上一级规模提高了193%。 最后,利用毕赤酵母和酿酒酵母发酵糖化产物产酒精,最大规模15L发酵试验得到稻草到酒精的转化率为9.27%,产品酒精浓度16.59mg/ml。 【关键词】：半纤维素降解菌 秸秆 固体发酵 高温糖化 乙醇
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：S216.2
【目录】：

• 摘要7-8
• Abstract8-10
• 1、引言10-20
• 1.1 水稻秸秆的组成与结构10-11
• 1.2 秸秆的利用现状和前景11-13
• 1.3 半纤维素酶降解机理及其理化性质13-14
• 1.3.1 半纤维素酶分子结构及降解机理13
• 1.3.2 半纤维素酶理化性质13-14
• 1.4 半纤维素降解菌的多样性14
• 1.4.1 半纤维素分解性细菌14
• 1.4.2 半纤维素分解性真菌14
• 1.5 半纤维素降解菌鉴别培养基14-15
• 1.6 秸秆发酵制乙醇的工艺15-16
• 1.7 木糖发酵16-17
• 1.8 燃料乙醇简介17
• 1.8.1 燃料乙醇的概念17
• 1.8.2 燃料乙醇的推广17
• 1.9 国内外研究进展17-18
• 1.9.1 国内研究进展17-18
• 1.9.2 国外研究进展18
• 1.10 课题研究意义及技术路线18-20
• 2 实验材料与方法20-32
• 2.1 实验材料20-23
• 2.1.1 原料及菌种20
• 2.1.2 培养基20-21
• 2.1.3 其他试剂及材料21-22
• 2.1.4 主要仪器22-23
• 2.2 实验方法23-32
• 2.2.1 半纤维素的制备23-24
• 2.2.2 样品的采集24
• 2.2.3 初筛菌株的确定24
• 2.2.4 复筛菌株的确定24-27
• 2.2.4.1 菌株鉴定25
• 2.2.4.2 木糖标准曲线的制作--还原糖浓度的测定25-26
• 2.2.4.3 粗酶液的制备及半纤维素酶活力的测定26-27
• 2.2.5 稻草降解过程的显微图片观察及降解液中糖分分析27-29
• 2.2.5.1 稻草降解过程的显微图片观察27-28
• 2.2.5.2 稻草降解液中糖分分析28-29
• 2.2.6 单菌固体发酵最适条件的确定29
• 2.2.7 混菌对固体发酵的影响29-30
• 2.2.7.1 纤维素降解菌和半纤维素降解菌不同混合对发酵的影响29
• 2.2.7.2 半纤维素降解菌不同混合比例对还原糖含量的影响29
• 2.2.7.3 接种顺序对固体发酵还原糖含量的影响29-30
• 2.2.8 秸秆发酵产酒精初步研究30-32
• 2.2.8.1 秸秆发酵产酒精初步研究30
• 2.2.8.2 重铬酸钾法测定乙醇含量30-32
• 3 结果与分析32-59
• 3.1 半纤维素的制备32
• 3.2 初筛菌株的确定32-35
• 3.2.1 不同菌源地菌株的分离及纯化32
• 3.2.2 刚果红半纤维素平板筛选32-35
• 3.3 复筛半纤维素降解菌的结果35-44
• 3.3.1 木糖标准曲线的绘制35
• 3.3.2 发酵时间对半纤维素降解菌酶活的影响35-36
• 3.3.3 初筛菌株酶活的测定36-37
• 3.3.4 初筛菌株稻草降解率的测定37-40
• 3.3.5 菌株鉴定结果40-42
• 3.3.6 稻草降解过程的显微图片观察及降解液中糖分分析42-44
• 3.3.6.1 稻草降解过程的显微图片42-43
• 3.3.6.2 稻草降解液中糖分分析43-44
• 3.4 固体发酵条件的确定44-54
• 3.4.1 单菌固体发酵最适条件的确定44-49
• 3.4.1.1 稻草豆粕比对固体发酵半纤维素酶活性的影响44-45
• 3.4.1.2 不同初始pH值对固体发酵中半纤维素酶活性的影响45-46
• 3.4.1.3 固体曲水料比对半纤维素酶活的影响46-47
• 3.4.1.4 装瓶量对半纤维素酶活的影响47-48
• 3.4.1.5 温度对固体发酵中半纤维素酶活的影响48
• 3.4.1.6 接种量对固体发酵半纤维素酶活的影响48-49
• 3.4.2 混菌对固体发酵的影响49-54
• 3.4.2.1 纤维素降解菌和半纤维素降解菌不同混合对发酵的影响50-52
• 3.4.2.2 半纤维素降解菌不同混合比例对还原糖含量的影响52-53
• 3.4.2.3 接种顺序对固体发酵还原糖含量的影响53-54
• 3.5 利用秸秆发酵产酒精的初步研究54-59
• 3.5.1 酒精标准曲线的绘制54
• 3.5.2 初级规模固体发酵生产酒精54-57
• 3.5.2.1 规模扩大后半纤维素酶活达到峰值时间55-56
• 3.5.2.2 最适糖化温度56-57
• 3.5.2.3 最适糖化时间57
• 3.5.3 次级规模固体发酵生产酒精57-59
• 4 讨论59-63
• 4.1 初筛菌株的确定59
• 4.2 复筛菌株的确定59-60
• 4.3 单菌固体发酵条件的确定60-61
• 4.4 混菌固体发酵条件的确定61
• 4.5 利用秸秆发酵产酒精的初步研究61-62
• 4.6 展望62-63
• 5 参考文献63-68
• 6 致谢68

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