基于FISH技术的秸秆干发酵中微生物动态变化的研究

【摘要】：沼气发酵是有机物在无氧环境下经微生物分解,将其中一部分碳素物质转化为甲烷和二氧化碳的生物化学过程。这一过程涉及多种微生物相互协调,联合交替,极为复杂。在不同发酵阶段,微生物的种类、数量和代谢活性均有变化,各微生物种群的代谢及相互作用直接影响沼气发酵的效率。本文研究了秸秆沼气干发酵各阶段微生物群落结构及其动态变化规律,以及发酵温度对干发酵过程的影响,探讨了微生物群落与基质特性之间的关系,旨在为优化秸秆沼气干发酵工艺,提高产气效率提供理论依据。 1.采用物理、化学以及酶处理的细胞破壁方法,提取秸秆沼气干发酵基质中微生物总DNA,对其纯度和得率进行了比较。结果表明：采用冻融处理和酶处理相结合的破壁处理方法最为有效,DNA纯度(A260／A280)和得率分别达到1.392±0.027和0.143±0.016mg/g; DNA纯化试剂盒纯化DNA粗提液,比吸附剂聚乙烯吡咯烷酮(PVP)纯化的纯度提高了34.6%,但A260／A280仍在1.8以下,未能达到利用PCR分析法对微生物进行定量的要求,因此不能作为本实验中微生物定量测定的有效方法。 2.优化了荧光原位杂交技术(FISH)定量测定秸秆厌氧干发酵基质中微生物的样品预处理条件,并在最优条件下做了验证性实验。结果表明：使用无水乙醇作为清洗液,FISH样品的荧光信号强度和丰度比用PBS清洗液(磷酸缓冲盐溶液)时有显著提高；样品预处理过程中加无菌玻璃珠震荡能提高微生物的分散度,从而提高FISH技术对秸秆厌氧发酵基质中微生物定量的准确性；采用离心转速为13000r/min时,微生物菌体收集率提高,而且还能保证完好的细胞形态,为后续的FISH杂交奠定基础。 3.以多聚甲醛固定时间、热固定时间、乙醇脱水时间、杂交温度、杂交时间为试验因素进行二次回归正交旋转组合试验,对FISH定量检测玉米秸秆厌氧干发酵基料中微生物的最佳杂交条件进行了优化。结果表明：最佳的杂交试验条件为多聚甲醛固定时间18h、热固定时间15min、乙醇脱水时间3min、杂交温度44℃、杂交时间1.5h。在该试验条件下观察的荧光显微图像菌量最多,荧光信号最为强烈,且菌体分辨清晰。 4.研究了温度对玉米秸秆厌氧干发酵基质特性及微生物群落结构变化规律的影响,探讨了基质特性与微生物群落结构之间的关系。结果表明：37℃和55℃条件下沼气发酵启动的均较快,乙酸化和甲烷化很快达到平衡,整个过程未出现明显的酸积累,反应体系的pH值和碱度变化较平稳,pH始终维持在适宜甲烷化菌生长的范围；20℃下由于甲烷化菌生长代谢缓慢,不能及时将产生的有机酸转化成甲烷,造成了一定的酸积累,而过度的酸积累又进一步抑制了甲烷化菌的生长繁殖和代谢,导致整个发酵过程中CH4含量始终处于较低水平；37℃和55℃下的微生物群落结构有明显差异,37℃乙酸甲烷菌数量变化较明显,且远远高于氢甲烷菌的数量,而55℃下氢甲烷化菌的数量占优势,说明37℃和55℃下产生甲烷的主要菌群分别是乙酸甲烷菌和氢甲烷化菌；在发酵前期,各类甲烷化菌的数量变化不明显,起主导作用的微生物是产酸型的细菌,它们将大分子有机物质快速分解成小分子酸,再将小分子酸进一步分解成丙酸、乙酸、丁酸；低温(20℃)、中温(37℃)和高温(55℃)发酵时,甲烷化菌的数量分别在第24天、第12天和第6天达到最大。由此可见随着温度的升高可使发酵周期缩短,提前达到峰值,大大提高了发酵效率和产气率。 【关键词】：秸秆 厌氧干发酵 FISH技术 微生物 温度
【学位授予单位】：山东理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：S216.4
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-11
• 第一章 绪论11-17
• 1.1 秸秆厌氧发酵微生物分类12-14
• 1.1.1 水解性细菌12-13
• 1.1.2 纤维素分解菌13
• 1.1.3 半纤维素分解菌13
• 1.1.4 白腐菌13
• 1.1.5 产氢产乙酸菌13-14
• 1.1.6 产甲烷的微生物14
• 1.2 厌氧发酵微生物的研究进展14-15
• 1.3 沼气发酵中微生物的测定方法15-16
• 1.4 本文的主要研究内容16-17
• 第二章 秸秆沼气干发酵基质中微生物DNA提取方法筛选17-26
• 2.1 引言17-18
• 2.2 试验材料18-19
• 2.2.1 原料18
• 2.2.2 试剂与仪器18-19
• 2.2.3 仪器19
• 2.3 试验方法19-21
• 2.3.1 总DNA的提取19-20
• 2.3.2 DNA粗提液的纯化20
• 2.3.2.1 PVP吸附纯化20
• 2.3.2.2 细菌DNA纯化试剂盒纯化20
• 2.3.3 DNA质量的测定20-21
• 2.3.3.1 DNA纯度的测定20-21
• 2.3.3.2 DNA产量的测定21
• 2.4 结果与分析21-24
• 2.4.1 不同方法提取的DNA纯度比较21-22
• 2.4.2 对DNA粗提液的纯化结果22-24
• 2.4.2.1 添加PVP对DNA粗提液的纯化效果22-23
• 2.4.2.2 利用纯化试剂盒对DNA粗提液进行纯化23-24
• 2.5 讨论24-25
• 2.6 本章小结25-26
• 第三章 基于秸秆厌氧干发酵的FISH预处理条件优化26-35
• 3.1 引言26-27
• 3.2 材料与方法27-30
• 3.2.1 样品来源27
• 3.2.2 主要试剂及仪器27-28
• 3.2.3 样品预处理试验方法28-29
• 3.2.3.1 清洗液成份的确定28
• 3.2.3.2 搅拌方式的确定28
• 3.2.3.3 离心转速的确定28-29
• 3.2.4 荧光原位杂交与计数29-30
• 3.3 结果与分析30-33
• 3.3.1 清洗液成份对FISH反应效果的影响30-31
• 3.3.2 搅拌方式对FISH反应效果的影响31-32
• 3.3.3 离心转速对FISH反应效果的影响32-33
• 3.4 讨论33-34
• 3.5 本章小结34-35
• 第四章 秸秆沼气干发酵中微生物FISH定量杂交条件优化35-50
• 4.1 材料与方法35-41
• 4.1.1 材料35
• 4.1.2 试剂35-36
• 4.1.3 仪器36-37
• 4.1.4 杂交处理试验方法37
• 4.1.5 二次回归正交旋转组合实验设计37-40
• 4.1.5.1 确定各因素水平上下限37
• 4.1.5.2 心点(零水平)的取值37-38
• 4.1.5.3 查表确认实验设计参数38
• 4.1.5.4 根据参数计算每个因素的变化区间△j38
• 4.1.5.5 对每个因素的水平编码38-39
• 4.1.5.6 杂交处理正交表39-40
• 4.1.6 利用FISH技术测定微生物数量40-41
• 4.1.6.1 样品的预处理及细胞固定40
• 4.1.6.2 载玻片的预处理及细胞脱水40-41
• 4.1.6.3 荧光原位杂交反应41
• 4.2 结果与分析41-48
• 4.2.1 荧光面积回归方程的建立42-43
• 4.2.2 荧光面积回归方程的建立和检验43-44
• 4.2.3 荧光面积二次回归方程的交互作用分析44-48
• 4.3 讨论48-49
• 4.4 本章小结49-50
• 第五章 温度对秸秆厌氧干发酵基质特性及微生物群落结构的影响50-63
• 5.1 材料与方法50-53
• 5.1.1 试验材料50
• 5.1.2 试验中所用探针50
• 5.1.3 仪器50-52
• 5.1.4 测定方法52-53
• 5.1.4.1 pH值的测定52-53
• 5.1.4.2 碱度的测定53
• 5.1.4.3 挥发性脂肪酸的测定53
• 5.1.4.4 气体分析53
• 5.2 结果与分析53-62
• 5.2.1 基质pH和碱度随发酵时间的变化规律53-55
• 5.2.2 挥发性脂肪酸随发酵时间的变化规律55-57
• 5.2.3 不同温度对发酵过程中基质VFA/TIC的影响57-58
• 5.2.4 在不同发酵阶段温度对产气情况的影响58-60
• 5.2.5 在不同发酵阶段温度对微生物变化的影响60-62
• 5.3 本章小结62-63
• 第六章 结论63-65
• 附录65-66
• 攻读硕士学位期间发表的论文66-67
• 致谢67-68
• 参考文献68-71

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