黑曲霉、绿色木霉的诱变选育及其在秸秆腐熟剂中的应用初探

【摘要】：中国是农业大国,秸秆作为一种重要的农业副产品,每年有数亿吨产生。由于对秸秆的有效利用率低,秸秆被任意焚烧的情况非常严重,不仅浪费了珍贵的可再生资源,更带来了火灾、大气污染等问题。利用微生物的作用,可以变废为宝,防止对秸秆的浪费及其带来的各种问题,有助于解决大气污染及能源问题。 本论文主要工作包括：1)从野外取样以及从实验室保存的菌株中获取纤维素酶和木聚糖酶酶活较高的菌株；2)对筛选所得菌依次进行离子束诱变和钴60诱变,获得相关酶活进一步提高的突变株,并研究突变株的遗传稳定性；3)对突变株所产酶的酶学性质进行研究；4)在实验室条件下,以获得的突变株为主体,研制成腐熟菌剂,并进行腐熟试验,研究其对水稻秸秆的腐解能力。 主要研究结果如下。 1.从野外分到一株黑曲霉菌株H13,其在产酶培养基中培养68h,木聚糖酶达到最高,为14000U/g;从实验室保存的菌株中获得一株绿色木霉M100726,其在产酶培养基中培养48h,羧甲基纤维素酶(CMCase)酶活达到最高,约为400U/g； 2.对H13依次进行离子束诱变与钴60诱变,最终得到遗传稳定的木聚糖酶高产菌株N65-7,其木聚糖酶活最高达到25700U/g；对M100726依次进行离子束诱变与钴60诱变,最终得到遗传稳定的CMCase高产菌株R16-1,其CMCase最高达到587U/g； 3.黑曲霉菌株N65-7的木聚糖酶的最适作用温度为50℃,最适作用pH为5.4,在4℃-40℃时酶热稳定性较好,50℃以上处理15min酶活有损失,pH5.4-pH10之间酶稳定性较好,Mg2+、Ca2+、吐温80、Cu2+对酶有促进作用,Co2+、Mn2+有较大抑制作用。绿色木霉菌株R16-1的CMCase的最适作用温度为50℃,最适作用pH为4.8,在4℃-40℃时酶热稳定性较好,50℃以上处理15min酶活有损失,pH3-pH11之间酶稳定性较好,Cu2+对CMCase酶有明显的促进作用,Co2+有较大抑制作用； 4.稻草腐熟试验中,与空白对照相比,实验组的外观、细菌总数、霉菌总数、有机碳含量、碳氮比、秸秆断裂拉力、秸秆残留率均有显著差异。在以R16-1与N65-7为主体制成的秸秆腐熟剂作用下,实验组秸秆约在35d左右达到完全腐熟,此时试验用的秸秆已呈破碎状、深褐色,生存的优势微生物为木霉以及黑曲霉,秸秆中的有机碳含量已降至34%,碳氮比为19.50,试验45d时,实验组秸秆断裂拉力约为试验前的3.3%,秸秆残留35.03%,以上均表明以R16-1与N65-7为主体制成的秸秆腐熟剂有较好的腐熟效果。 【关键词】：秸秆 腐熟剂 菌株诱变 选育 腐熟试验
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：S141
【目录】：

• 目录4-7
• 摘要7-9
• Abstract9-11
• 缩略语表11-12
• 1 前言12-23
• 1.1 秸秆及其应用现状12-16
• 1.1.1 用于生物质能源13-14
• 1.1.2 利用秸秆种植食用菌14
• 1.1.3 用于动物饲料14-15
• 1.1.4 用于工业加工15
• 1.1.5 秸秆还田15-16
• 1.2 纤维素和纤维素酶16-17
• 1.3 半纤维素及半纤维素酶17-18
• 1.4 纤维素酶、木聚糖酶高产菌株研究进展18-19
• 1.5 秸秆腐熟剂的研究进展19-20
• 1.6 本课题的研究目的、研究内容和技术路线20-23
• 1.6.1 研究目的20
• 1.6.2 研究内容20-22
• 1.6.3 技术路线22-23
• 2 材料与方法23-35
• 2.1 材料23-25
• 2.1.1 培养基23
• 2.1.2 仪器与设备23-24
• 2.1.3 溶液与试剂24-25
• 2.2 方法25-35
• 2.2.1 酶活测定方法25-28
• 2.2.2 菌种初筛28
• 2.2.3 黑曲霉离子束诱变28-29
• 2.2.4 黑曲霉钻60诱变29-30
• 2.2.5 木霉的离子束诱变30
• 2.2.6 木霉钴60诱变30-31
• 2.2.7 黑曲霉N65与木霉R16的遗传稳定性研究31
• 2.2.8 N65木聚糖酶酶学性质研究31-32
• 2.2.9 R16 CMCase酶学性质研究32-33
• 2.2.10 稻草腐熟试验33-35
• 3 结果与分析35-62
• 3.1 标准曲线35-36
• 3.1.1 葡萄糖标准曲线的绘制35
• 3.1.2 木糖标准曲线的绘制35-36
• 3.2 菌种初筛结果36-39
• 3.2.1 菌种材料的获取36-37
• 3.2.2 M100726与H13的形态观察37
• 3.2.3 M100726的产CMCase曲线和产孢子曲线37-38
• 3.2.4 H13的产木聚糖酶曲线与产孢子曲线38-39
• 3.3 木聚糖酶高产菌株的诱变选育39-46
• 3.3.1 H13的离子束诱变39-43
• 3.3.2 Y33的钴60诱变43-45
• 3.3.3 N65的遗传稳定性45-46
• 3.4 CMCase高产菌株的诱变选育46-51
• 3.4.1 M100726的离子束诱变46-49
• 3.4.2 M100726的钴60诱变49-51
• 3.4.3 R16的遗传稳定性51
• 3.5 酶学性质研究51-56
• 3.5.1 木聚糖酶酶学性质研究51-53
• 3.5.2 R16 CMCase酶学性质研究53-56
• 3.6 稻草腐熟试验56-62
• 3.6.1 稻草腐熟过程中外观的变化56-57
• 3.6.2 腐熟过程中各处理pH变化57
• 3.6.3 腐熟过程中各处理含水率变化57-58
• 3.6.4 腐熟过程中各处理细菌总数变化58
• 3.6.5 腐熟过程中各处理霉菌总数变化58-59
• 3.6.6 腐熟过程中各处理有机碳的变化59
• 3.6.7 腐熟过程中各处理总氮的变化59-60
• 3.6.8 秸秆腐熟过程中碳氮比变化60
• 3.6.9 秸秆断裂拉力变化60-61
• 3.6.10 腐熟试验结束后各处理的秸秆残留率比较61-62
• 4 结论62-63
• 5 讨论63-65
• 参考文献65-70
• 致谢70

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