玉米秸秆蛋白发酵饲料中木质纤维素酶高产菌株的选育及应用

【摘要】：世界上纤维原料资源丰富，将纤维资源转化后可实现生产酒精、单细胞蛋白等物质的目的。这不仅充分利用了自然资源，而且防止了由于纤维原料的丢弃产生的污染。其中纤维原料转化是实现纤维原料合理化利用的重要步骤。纤维原料的转化包括纤维原料的预处理和纤维素酶的酶解。本文主要从纤维原料秸秆的预处理及纤维素酶的生产两个重要方面进行了探讨。 首先通过单因素实验确定了玉米秸秆高压蒸煮锅中蒸煮的最佳预处理条件：用碱量为14%、固液比为1:7、保温温度为130℃1h＋140℃1h，该预处理条件下处理后的玉米秸秆其纸浆卡伯值出现最低，残碱和纸浆得率也较为合理。此时其卡伯值为12.43，制浆得率为56.7%。随后利用购买的纤维素酶及木聚糖酶对预处理后的秸秆进行酶解，进一步确定了上述最佳预处理条件。利用最优预处理秸秆进行酶解，通过一系列实验确定了最佳酶解条件：三角瓶中装入100mL浆浓度为3%的预处理秸秆，纤维素酶用量为100U/g，木聚糖酶用量为600U/g，酶解pH值为4.8，48℃恒温培养箱中摇瓶酶解72h。此时酶解液中还原糖含量积累达到最大，为25.6mg/mL。 以实验室保藏的绿色木霉为出发菌株，通过两次紫外与两次DES的交替诱变对绿色木霉的出发菌株进行了诱变筛选。在以醋酸纤维素钠为唯一碳源的刚果红培养基上筛选出一株透明圈较大的菌株Hc=2.1，经多次复筛后，得到了一株生长较好酶活较高的突变株，编号T.viride8140UEUE4-80，其纤维素酶活达到了22.79U/mL、FDA酶活达到了2.56U/mL、木聚糖酶活达到了38.09U/mL，分别比原始菌株提高了2倍、1.5倍和1.3倍。对突变株的传代稳定性进行了研究，得到的突变株产酶稳定性良好，酶活下降极少，说明获得的突变株T.viride8140UEUE4-80可以用来进行后续培养。 对绿色木霉突变株Trichoderma viride8140UEUE4-80的液态产酶培养基及培养条件进行了优化。实验通过对菌株液态产酶培养基中的碳源、氮源、pH值、金属离子及表面活性剂的研究，确定了最佳产酶培养基中各成分及其含量：1000mL营养盐成分：(NH4)SO42.0g/L、KH2PO42.0g/L、Urea0.3g/L、Peptone0.75g/L、CaCl20.3g/L、MgSO40.3g/L、FeSO4﹒7H2O5.0mg/L、MnSO4﹒H2O1.6mg/L、ZnSO4﹒7H2O1.4mg/L、CoCl22.0mg/L，微晶纤维素10g/L，麸皮10g/L，吐温-802mL/L，pH6。实验通过对菌株液态培养培养条件的研究，包括培养温度、装液量与摇床转速、接种方式及接种量。确定了最佳产酶培养条件为：培养温度28℃、装液量为50mL/300mL、摇床转速为180r/min、接种方式为种子液接种、接种量为5%。在此培养条件下，以最佳培养基培养6天后，CMCase达到24.91U/mL、FPA酶活达到2.81U/mL、木聚糖酶活达到105.5U/mL，三种酶活均有明显提高。 在固体培养下探讨了绿色木霉突变株的产酶情况，对产酶最佳培养基及培养条件进行了实验，1)对产酶培养基中的碳源、氮源及无机盐离子进行了研究，确定了最佳固态培养基成分为：麸皮：秸秆：豆粕=6:3:1、磷酸二氢钾0.3%、硫酸铵0.45%、尿素0.15%、无水氯化钙0.15%、七水硫酸镁0.2%。 2)固定最佳培养基后，分别对产酶过程中的含水量、装料量、温度及接种量进行研究，确定了绿色木霉T.viride8140UEUE4-80在三角瓶中最佳固态产酶培养条件为：固液比为1:2、装料量为20g/500mL（此时培养基厚度为1cm）、培养温度为32℃及接种量为10%。在此培养条件下CMCase达到47.04U/g、FPA酶活达到10.07U/g、木聚糖酶活达到1015U/g。 3)在三角瓶固态培养的基础上，按在三角瓶中固态培养的培养基及培养条件，进行了曲盒中的扩大培养的研究，绿色木霉在曲盒中固态培养条件下生长较好，最高CMCase达到43.3U/g、FPA酶活达到8.2U/g、木聚糖酶活994U/g。可进行后续培养以实现规模化生产。 【关键词】：玉米秸秆 预处理 绿色木霉 突变 纤维素酶
【学位授予单位】：中国海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：TQ914.3;TQ925
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-14
• 0 文献综述14-33
• 0.1 木质纤维素的结构、组成成分及利用情况14-18
• 0.1.1 木质纤维的结构与组成成分14-15
• 0.1.2 秸秆资源的利用现状及应用前景15-18
• 0.2 植物纤维的预处理方式概述18-22
• 0.2.1 物理法18-20
• 0.2.2 化学方法20-21
• 0.2.3 生物方法21-22
• 0.3 绿色木霉的简介22-24
• 0.3.1 绿色木霉在发酵中的应用22-23
• 0.3.2 绿色木霉的应用前景23-24
• 0.4 纤维素及纤维素酶的概述24-28
• 0.4.1 纤维素概述24-25
• 0.4.2 纤维素酶概述25-28
• 0.5 玉米秸秆蛋白饲料28-29
• 0.5.1 秸秆饲料28-29
• 0.5.2 秸秆蛋白发酵饲料29
• 0.6 研究内容及意义29-33
• 0.6.1 研究意义29-31
• 0.6.2 研究内容31-33
• 1 秸秆的预处理及其酶解33-52
• 1.1 引言33
• 1.2 实验材料与仪器33-34
• 1.2.1 实验材料33
• 1.2.2 主要试剂33-34
• 1.2.3 实验仪器34
• 1.3 实验内容及方法34-38
• 1.3.1 原料的水分测定34
• 1.3.2 玉米秸秆的预处理34-35
• 1.3.3 制浆得率的测定35
• 1.3.4 黑液中残碱的测定35
• 1.3.5 卡伯值的测定35
• 1.3.6 葡萄糖标准曲线的制定35-36
• 1.3.7 固体酶酶活的测定及酶液制备36-37
• 1.3.8 预处理后秸秆的酶解37
• 1.3.9 秸秆浆浓度的确定37
• 1.3.10 酶用量的确定37-38
• 2.3.11 酶解时间、酶解温度、酶解 pH 的确定38
• 2.3.12 酶解后总还原糖含量测定38
• 1.4 结果与分析38-50
• 1.4.1 预处理条件的确定38-43
• 1.4.2 葡萄糖标准曲线43
• 1.4.3 酶解条件的确定43-50
• 1.5 小结50-52
• 2 绿色木霉的诱变筛选52-68
• 2.1 引言52
• 2.2 实验材料与仪器52-54
• 2.2.1 实验材料52-53
• 2.2.2 实验仪器53-54
• 2.3 实验方法54-57
• 2.3.1 菌种培养及纤维素酶菌株的筛选方法54
• 2.3.2 粗酶液提取及酶活测定54
• 2.3.3 标准曲线制作54-55
• 2.3.4 菌体生物量的测定55
• 2.3.5 菌种诱变55-57
• 2.4 结果和分析57-67
• 2.4.1 葡萄糖、木糖标准曲线57
• 2.4.2 出发菌株的发酵特性57-59
• 2.4.3 诱变选育结果59-62
• 2.4.4 变异株 T.viride8140UEUE4-80 与出发菌株的特性比较62-65
• 2.4.5 诱变菌株稳定性研究结果65-67
• 2.5 小结67-68
• 3 突变菌株液态培养下培养基及培养条件的研究68-81
• 3.1 引言68
• 3.2 实验材料和仪器68-69
• 3.2.1 实验材料68
• 3.2.2 实验仪器68-69
• 3.3 实验方法及实验设计69-71
• 3.3.1 实验方法69-70
• 3.3.2 实验设计70-71
• 3.4 实验结果与分析71-80
• 3.4.1 培养基中碳源的影响71-74
• 3.4.2 培养基中氮源的确定74-75
• 3.4.3 培养基的 pH 对产酶的影响75-76
• 3.4.4 金属离子对产酶的影响76
• 3.4.5 表面活性剂对产酶影响76-77
• 3.4.6 最佳培养基配方77-78
• 3.4.7 培养温度优化78
• 3.4.8 装液量及摇床转速对产酶的影响78-79
• 3.4.9 接种方式选择79
• 3.4.10 接种量的选择79-80
• 3.4.11 最佳培养条件80
• 3.5 小结80-81
• 4 绿色木霉固态培养的研究81-95
• 4.1 引言81
• 4.2 实验材料及仪器81-82
• 4.2.1 实验材料81-82
• 4.2.2 实验仪器82
• 4.3 实验方法82-85
• 4.3.1 菌种培养方法82-83
• 4.3.2 酶活测定83
• 4.3.3 固态培养培养基优化83-84
• 4.3.4 培养条件优化84
• 4.3.5 扩大培养84-85
• 4.4 实验结果与分析85-94
• 4.4.1 绿色木霉 T.viride8140UEUE4-80 固态培养下产酶曲线85-86
• 4.4.2 碳源优化结果86-87
• 4.4.3 氮源优化结果87-88
• 4.4.4 无机盐离子添加优化的结果88-89
• 4.4.5 最优培养基89
• 4.4.6 固液比的优化结果89-90
• 4.4.7 装料量的优化结果90-91
• 4.4.8 温度对产酶的影响91
• 4.4.9 接种量对产酶的影响91-92
• 4.4.10 最佳培养条件92
• 4.4.11 曲盒中扩大培养的产酶曲线92-94
• 4.5 小结94-95
• 5 研究结论与展望95-98
• 5.1 研究结论95-96
• 5.2 问题及展望96-98
• 参考文献98-104
• 致谢104-105
• 个人简历105
• 发表的学术论文105-106

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