RNA干涉ZmC4H基因影响玉米秸秆木质素含量的研究

【摘要】：玉米(Zea Mays L.)秸秆丰要是木质素,纤维素和半纤维素三种大分子物质组成的。木质素具有增强植物抗压能力和运输水分的作用。由于木质素的结构复杂难以被分解,所以在生产中的利用效率非常低下,对纸张制造及生物燃料等生产造成不必要的能源消耗。本文利用基因工程手段,运用分子技术控制植物木质素的生物合成,降低木质素的含量,这对提高玉米秸秆的使用效率具有重要的意义。本文以玉米B73自交系为植物材料,利用RNAi技术,对木质素合成关键酶肉桂酸-4-羟基化酶(C4H)基因进行反义抑制,构建了C4H的干涉表达载体,通过农杆菌介导的玉米茎尖遗传转化,并对得到的后代植株进行抗除草剂筛选,同时对转C4H基因的植株进行分子检测和木质素含量检测,取得如下主要结果：1、利用PCR技术克隆得到C4H基因的部分序列,以pUCCRNAi与改造过含有Bar及CaMV35S的pCAM1301载体作为中间载体,通过基因工程成功构建RNA干涉载体pCAM1301+C4H。2、将pCAM1301+C4H干涉表达载体通过农杆菌介导转到玉米自交系郑58中,获得了抗除草剂的转基因植株。3、对获得的T1代植株进行分子PCR检测,对获得的转基因植株进行RT-PCR分析和木质素及纤维素进行测定,结果显示：RNAi降低了玉米C4H基因的表达水平,转基因植株Klason木质素含量与野生型相比平均降低了23.50%,纤维素含量与对照相比平均降低了8.11%。4、将转基因植株的茎秆制作切片并进行番红染色在显微成像系统下观察,发现转基因植株维管束的染色程度较对照植株的浅,证明抑制玉米C4H基因的表达水平能够降低了植株木质素的含量。5、对转基因玉米植株秸秆的纤维长度和结晶度进行了测量,发现转基因株的纤维长度与对照相比平均增加了8.29%,玉米纤维结晶度值与对照相比平均降低了17.80%。综上所述,本文成功构建了RNA干涉表达载体pCAM1301+C4H,并将pCAM1301+C4H通过农杆菌介导转化,获得转基因植株；转基因玉米秸秆的木质素和纤维素含量均比对照降低,其中纤维素的下降幅度低于木质素的下降幅度。 【关键词】：玉米 RNAi C4H 木质素 纤维素
【学位授予单位】：安徽农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：Q943.2;S513
【目录】：

• 摘要3-4
• Abstract4-9
• 1 文献综述9-16
• 1.1 木质素的概述9-11
• 1.2 木质素的生物合成途径上的关键酶类11-14
• 1.2.1 苯丙酸合成途径涉及的酶类11-13
• 1.2.2 木质素特异合成途径中的酶类13
• 1.2.3 木质素特异合成途径下游酶类的调控13-14
• 1.3 肉桂酸4-羟基化酶的国内外研究现状14-16
• 1.3.1 C4H基因的酶学性质14
• 1.3.2 肉桂酸-4-羟化酶在木质素生物合成中的作用14-16
• 2 引言16-17
• 3. 材料与方法17-31
• 3.1 实验材料17
• 3.1.1 植物材料17
• 3.1.2 实验载体与菌株17
• 3.2 实验主要试剂17
• 3.3. 培养基17
• 3.4 实验主要仪器17
• 3.5 实验所用溶液的配制17-19
• 3.5.1 CTAB溶液的配置17-18
• 3.5.2 碱裂解法提取质粒DNA的溶液配制18
• 3.5.3 培养基相关溶液的配制18-19
• 3.5.4 抗生素的配置19
• 3.6 米C4H基因的克隆19-21
• 3.6.1 PCR反应及琼脂糖电泳19-20
• 3.6.2 PCR扩增目的片段及产物回收20-21
• 3.7 P1301+C4H干涉表达载体的构建21-23
• 3.7.1 C4H RNAi载体的构建方案21
• 3.7.2 目的片段与pUCCRNAi载体酶切连接21-23
• 3.8 p1301+C4H干涉表达载体转化农杆菌23-24
• 3.8.1 农杆菌感受态细胞的制备23
• 3.8.2 冻融法质粒导入农杆菌23-24
• 3.8.3 干涉表达载体转化农杆菌24
• 3.9 玉米的茎尖转化24-25
• 3.9.1 工程菌的制备24
• 3.9.2 玉米种子的消毒与萌发24
• 3.9.3 诱导与侵染24-25
• 3.9.4 侵染苗的移栽与筛选25
• 3.10 转基因植株的分子检测25-26
• 3.10.1 转基因植株的PCR检测25
• 3.10.2 转基因植株的半定量RT-PCR分析25-26
• 3.11 木质素、纤维素含量的测定及实验方法26-29
• 3.11.1 制取草粉26-27
• 3.11.2 水分含量的测定27
• 3.11.3 木质素含量的测定27-28
• 3.11.4 纤维素含量的测定28-29
• 3.12 番红染色29
• 3.13 玉米秸秆纤维长度测量29-30
• 3.14 结晶度测量30-31
• 4 结果与分析31-39
• 4.1 目的基因片段的获得31
• 4.2 载体构建验证31-33
• 4.2.1 pUCCRNAi+2F载体构建验证31-33
• 4.3 干涉载体导入农杆菌的验证及转基因植株的获得33-34
• 4.3.1 干涉载体的PCR验证33
• 4.3.2 转基因植株的获得33-34
• 4.4 转C4H基因植株的检测34-39
• 4.4.1 转C4H基因植株的PCR检测34-35
• 4.4.2 转基因植株的半定量RT-PCR检测35-36
• 4.4.3 转基因植株的Klason木质素与纤维素的测定36-37
• 4.4.4 转基因植株的组织化学染色观察37-38
• 4.4.5 转基因植株秸秆纤维长度及结晶度测量38-39
• 5 讨论39-41
• 5.1 C4H基因的下调对玉米木质素、纤维素含量及纤维长度和结晶度的影响39-40
• 5.2 抑制C4H表达对植株的正常生长的影响40-41
• 6 结论41-42
• 参考文献42-49
• 致谢49-50
• 个人简介50-51
• 研究成果51

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