产酸芽孢杆菌的分离筛选及对玉米秸秆的微贮效果

【摘要】：青贮是秸秆饲料化利用较为成熟的技术,可以最大限度地保存秸秆中的营养物质,为畜牧养殖业提供较为廉价优质的饲草。目前,用于秸秆青贮的微生物添加剂主要是乳酸菌类,然而乳酸菌不耐高温,在生产和贮存过程中易失活,质量不稳定,影响了其使用效果。针对这一问题,本研究拟分离筛选可以发酵产酸的芽孢杆菌菌株,制备微贮菌剂,用于鲜玉米秸秆的贮存。首先从牛粪等样品中共分离得到了芽孢菌菌株200余株,利用变色圈法从中初筛出13株可使溴甲酚紫变黄的产酸菌株。利用平板培养基打孔法对这13株菌进行了复筛,最终获得1株产酸量较高的芽孢杆菌R42-16菌株。该菌株可以发酵糖产生多种有机酸,其中乙酸、乳酸的产量较高,液体发酵条件下分别为220.70μg/m L、174.25μg/m L。根据菌落形态、菌体特征、生理生化试验、以及16S r DNA序列分析,菌株R42-16被鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。对R42-16菌株的生物学特性进行研究发现,该菌株对酸、胆酸盐具有较强的耐受性,耐受p H的范围为1.0~7.0,耐受胆酸盐的范围为0.1%~0.3%;该菌株对蔗糖、果糖的利用率均较高;同时,菌株R42-16对致病大肠杆菌O157:H7具有较强的拮抗活性。通过单因素试验和正交试验,对菌株R42-16的培养基组成和培养条件进行了优化。优化培养基为:玉米粉1.0%、酵母浸粉2.0%、Mn SO4·H2O 0.01%、Ca Cl2·H2O 0.01%;适宜的培养条件为:培养基p H6.0、装液量为50m L/250m L三角瓶、接种量为4.0m L/瓶、发酵时间为48h。在此培养条件下,发酵液中菌株R42-16的活菌数为3.19×109CFU·m L-1,芽孢形成率为93.76%。对菌株R42-16对玉米秸秆的发酵效果进行了评价。设定菌剂施用量分别为8.0×108 CFU/kg(试验组Ⅰ)、1.0×109 CFU/kg(试验组Ⅱ)和1.2×109 CFU/kg(试验组Ⅲ),发酵30d,对各试验组秸秆的营养指标对比如下:与青贮对照组相比,试验组Ⅰ中的乳酸、乙酸含量差异不显著(p0.05),试验组Ⅱ、试验组Ⅲ中两者的含量均显著增加(p0.05),试验组Ⅱ、试验组Ⅲ的乳酸含量分别提高24.38%、25.0%,乙酸含量分别提高292.87%、338.52%。但试验组Ⅱ和试验组Ⅲ之间差异不显著(p0.05)。试验组Ⅰ中的丁酸含量、氨态氮/总氮与对照组相比差异不显著(p0.05),而试验组Ⅱ、试验组Ⅲ与对照组相比,显著降低(p0.05),试验组Ⅱ、试验组Ⅲ的丁酸含量分别降低了47.34%、53.36%;氨态氮/总氮分别降低了36.89%、42.33%。但试验组Ⅱ、试验组Ⅲ之间差异不显著(p0.05)。试验组Ⅰ的粗蛋白含量与对照组相比,差异不显著(p0.05),试验组Ⅱ、试验组Ⅲ与对照组相比,含量显著增加(p0.05),试验组Ⅱ、试验组Ⅲ的粗蛋白含量分别为8.43%、9.11%,与对照组相比分别增加了50.26%、62.39%。但是,各试验组的干物质、粗纤维、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维、酸性洗涤木质素含量等指标差异不显著(P0.05)。针对青贮秸秆暴露在空气中(开窖后)容易产生“二次发酵”的问题,本文从物料温度、p H、气味感官等方面对发酵秸秆进行了有氧稳定性的测定。结果表明,在室温为18℃的条件下,三个试验组和青贮对照组在第1-8天时料温均接近于室温。对照组在第9天时料温开始上升,第10天时料温高于室温1.57℃,此时青贮秸秆开始呈现不稳定状态,第14天时料温高于室温3.09℃,呈现“二次发酵”症状。而此时试验组的料温仅高于室温1.1℃左右。测定秸秆的p H变化发现,在第1-8天时青贮对照组与试验组的p H相差均不大,对照组p H在第10-12天时上升较快,在第12天时已经达到了5.59。一般认为秸秆的p H达到5.0时即发生了“二次发酵”,当p H为5.5时秸秆不能再饲喂。但试验组Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ在第15天时的p H分别为4.23、4.03、4.03。表明在秸秆中添加菌株R42-16能够提高发酵玉米秸秆的稳定性。综上所述,菌株R42-16可以作为微生物添加剂应用于玉米秸秆的微贮。 【关键词】：玉米秸秆 青贮 微贮 芽孢杆菌 发酵 有机酸 有氧稳定性
【学位授予单位】：河北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S816.53
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-12
• 第1章 前言12-17
• 1.1 青贮秸秆的微生物发酵机理及发酵过程12-13
• 1.1.1 青贮秸秆的发酵机理12
• 1.1.2 青贮秸秆的发酵过程12-13
• 1.2 影响秸秆发酵品质的因素13-14
• 1.2.1 水溶性碳水化合物13
• 1.2.2 水分13-14
• 1.2.3 缓冲力14
• 1.2.4 密封性14
• 1.3 秸秆青贮添加剂的研究进展14-15
• 1.3.1 添加青贮添加剂的目的14
• 1.3.2 青贮添加剂的种类14
• 1.3.3 细菌添加剂菌株的选择14-15
• 1.3.4 乳酸菌添加剂的效果及不足15
• 1.4 芽孢杆菌添加剂15-16
• 1.5 本文的研究内容及目的意义16-17
• 第2章 产酸芽孢杆菌的分离、筛选及鉴定17-25
• 2.1 试验材料17-18
• 2.1.1 样品17
• 2.1.2 培养基17
• 2.1.3 试剂17
• 2.1.4 试验仪器17-18
• 2.2 试验方法18-19
• 2.2.1 溴甲酚紫平板的制作18
• 2.2.2 菌株初筛18
• 2.2.3 菌株复筛18
• 2.2.4 菌株产物鉴定18
• 2.2.5 菌株的鉴定18-19
• 2.3 试验结果19-23
• 2.3.1 初筛试验结果19-20
• 2.3.2 复筛试验结果20
• 2.3.3 菌株鉴定20-22
• 2.3.4 产物鉴定结果22-23
• 2.4 讨论23-25
• 第3章 解淀粉芽孢杆菌R42-16 菌株的生物学特性25-31
• 3.1 试验材料25
• 3.1.1 供试菌株25
• 3.1.2 培养基25
• 3.1.3 试验仪器25
• 3.2 试验方法25-27
• 3.2.1 菌株R42-16 的生长曲线测定25
• 3.2.2 菌株R42-16 对酸的耐受性25-26
• 3.2.3 菌株R42-16 对胆酸盐的耐受性26
• 3.2.4 菌株R42-16 对蔗糖的利用26
• 3.2.5 菌株R42-16 对果糖的利用26
• 3.2.6 菌株R42-16 对致病大肠杆菌的拮抗活性26
• 3.2.7 菌株R42-16 产纤维素酶的能力26
• 3.2.8 菌株R42-16 产蛋白酶的能力26-27
• 3.3 试验结果27-30
• 3.3.1 菌株R42-16 的生长曲线27
• 3.3.2 菌株R42-16 对酸的耐受性27-28
• 3.3.3 菌株R42-16 对胆酸盐的耐受性28
• 3.3.4 菌株R42-16 对蔗糖的利用28
• 3.3.5 菌株R42-16 对果糖的利用28-29
• 3.3.6 菌株R42-16 对大肠杆菌的拮抗活性29
• 3.3.7 菌株R42-16 产纤维素酶的能力29-30
• 3.3.8 菌株R42-16 产蛋白酶的能力30
• 3.4 讨论30-31
• 第4章 解淀粉芽孢杆菌R42-16 菌株产芽孢条件优化31-39
• 4.1 试验材料31
• 4.1.1 供试菌株31
• 4.1.2 培养基31
• 4.2 试验方法31-32
• 4.2.1 菌株种子培养31
• 4.2.2 菌株发酵培养31
• 4.2.3 单因素试验31-32
• 4.2.4 培养基组成和发酵条件的优化32
• 4.2.5 测定方法32
• 4.3 试验结果32-38
• 4.3.1 碳源对菌株R42-16 菌体生长及芽孢形成的影响32-33
• 4.3.2 氮源对菌株R42-16 菌体生长及芽孢形成的影响33-34
• 4.3.3 无机盐对菌株R42-16 菌体生长及芽孢形成的影响34-35
• 4.3.4 培养基组成正交优化试验结果35-36
• 4.3.5 培养条件正交优化的试验结果36-38
• 4.4 讨论38-39
• 第5章 解淀粉芽孢杆菌R42-16 对秸秆发酵品质的影响39-44
• 5.1 试验材料39
• 5.1.1 玉米秸秆39
• 5.1.2 菌液39
• 5.1.3 试验仪器39
• 5.2 试验方法39-40
• 5.2.1 玉米秸秆发酵39-40
• 5.2.2 发酵玉米秸秆的水分、pH、有机酸、氨态氮的测定40
• 5.2.3 发酵玉米秸秆的营养成分测定40
• 5.3 试验结果40-42
• 5.3.1 发酵玉米秸秆水分、pH、有机酸、氨态氮的测定40-41
• 5.3.2 发酵玉米秸秆的营养成分分析41-42
• 5.4 讨论42-44
• 第6章 发酵玉米秸秆有氧稳定性的研究44-47
• 6.1 试验材料44
• 6.1.1 发酵玉米秸秆44
• 6.1.2 试验仪器44
• 6.2 试验方法44
• 6.3 试验结果44-45
• 6.3.1 发酵玉米秸秆感官评定44
• 6.3.2 发酵玉米秸秆的料温变化44-45
• 6.3.3 发酵玉米秸秆的有氧稳定性pH值变化45
• 6.4 讨论45-47
• 结论47-48
• 参考文献48-52
• 在读期间发表论文52-53
• 作者简历53-54
• 致谢54-55

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