黄孢原毛平革菌发酵秸秆产乙醇工艺的优化及菌株改良

【摘要】：经济的飞速发展使得能源问题日益突出,石油价格不断上涨,生物质能源的开发迫在眉睫。其中乙醇以其清洁、可再生的优点受到重视。我国燃料乙醇产业起步较晚但发展迅速,目前国家已将燃料乙醇的发展方向调整为以秸秆等非粮作物为主体原料。黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)是一株典型的白腐真菌,被广泛应用于纤维素和木质素材料的降解,可以实现对玉米秸秆中纤维素的降解。并且乙醇是P.chrysosporium降解纤维素过程中重要的次级代谢产物。本文由此立题,首次尝试利用P.chrysosporium降解秸秆直接进行乙醇发酵。本研究首先对P.chrysosporium在液体和固态发酵条件下利用秸秆产乙醇的培养基和发酵条件进行了优化。然后利用紫外照射的诱变方法对P.chrysosporium进行诱变育种,经发酵验证乙醇产量后对乙醇产量和稳定性最好的突变菌株Y2-5进行乙醇脱氢酶(Alcohol dehydrogenase,ADH)基因的序列分析。主要研究成果包括如下几方面:(1)P.chrysosporium发酵玉米秸秆在液态条件下的最佳培养基配方为:玉米秸秆粉20 g/L,葡萄糖10 g/L,酒石酸铵2.4 g/L,吐温80 0.4%。(2)最佳发酵条件为:装液量20%,初始p H 4.5,温度37℃,转速180 rpm,孢子悬液接种量2%(孢子数≥107个/m L),发酵时长11 d。优化之后乙醇产量最高达到3.692 g/L,较优化前提高了163%。(3)固态发酵需要预先经1%的H2SO4溶液进行酸处理。酸处理后的秸秆中木质素和半纤维素结构含量明显减少,相应纤维素含量增加了35%。(4)最佳固态发酵条件为:含水量60%,外源营养物为优化后液体培养基,玉米和麸皮混合比例为6:4,33℃静置发酵11 d。乙醇产量达到1.562 g/100g DS。(5)P.chrysosporium紫外诱变最佳照射时长为180 s。并得到三株具有较高乙醇脱氢酶(ADH)活性的诱变菌株Y1、Y2-1和Y2-5。在优化后的培养条件下乙醇产量较出发菌株提高约10%。(6)突变菌株Y2-5具有较好的遗传稳定性,ADH活力在第8 d达到峰值210 U/L,高于出发菌株约12%。(7)突变株Y2-5与已知P.chrysosporium乙醇脱氢酶蛋白的预测三维结构比对发现突变后新增了一个NAD酶合成有效位点。 【关键词】：秸秆 纤维素乙醇 黄孢原毛平革菌 诱变
【学位授予单位】：河南师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：TQ223.122
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-12
• 第一章 前言12-22
• 1.1 乙醇的传统生产工艺12
• 1.2 生物乙醇的发展现状12-13
• 1.3 再生纤维素原料简介13-16
• 1.3.1 纤维素（Cellulose）14-15
• 1.3.2 木质素（Lignin）15
• 1.3.3 半纤维素（Hemi-cellulose）15
• 1.3.4 作物秸秆的利用15-16
• 1.4 发酵秸秆产乙醇技术16-17
• 1.5 黄孢原毛平革菌简介17
• 1.6 黄孢原毛平革菌的功能和应用17-18
• 1.7 乙醇脱氢酶的作用18-19
• 1.8 微生物诱变育种技术19-20
• 1.8.1 诱变育种技术的研究进展19
• 1.8.2 诱变育种的特点19-20
• 1.9 课题研究目的和意义20-22
• 第二章 P. chrysosporium液体发酵秸秆产乙醇和发酵条件的优化22-43
• 引言22
• 2.1 材料与方法22-29
• 2.1.1 实验材料22-23
• 2.1.2 实验方法23-29
• 2.2 结果与分析29-41
• 2.2.1 P. chrysosporium发酵产酶曲线29-30
• 2.2.2 装液量对乙醇产量的影响30-31
• 2.2.3 发酵时长对乙醇产量的影响31-32
• 2.2.4 氮源种类对乙醇产量的影响32-33
• 2.2.5 氮源浓度对乙醇产量的影响33-34
• 2.2.6 碳源种类对乙醇产量的影响34-35
• 2.2.7 葡萄糖浓度对乙醇产量的影响35-36
• 2.2.8 吐温80对乙醇产量的影响36-37
• 2.2.9 培养温度对乙醇产量的影响37-38
• 2.2.10摇床转速对乙醇产量的影响38-39
• 2.2.11 初始p H对乙醇产量的影响39-40
• 2.2.12 还原糖含量的测定40-41
• 2.3 结论与展望41-43
• 2.3.1 本章结论41
• 2.3.2 展望41-43
• 第三章 P. chrysosporium固体发酵秸秆产乙醇工艺优化43-54
• 引言43
• 3.1 材料与方法43-44
• 3.1.1 菌株43
• 3.1.2 培养基43
• 3.1.3 基质43-44
• 3.1.4 主要试剂和仪器44
• 3.2 实验方法44-48
• 3.2.1 测定方法44
• 3.2.2 乙醇的测定方法44
• 3.2.3 纤维素酶酶活的测定方法44
• 3.2.4 木质素过氧化物酶（Li P）酶活测定44
• 3.2.5 菌株的活化与孢子悬液的制备44-45
• 3.2.6 预处理方式的选择45-47
• 3.2.7 物料含水量对乙醇产量的影响47
• 3.2.8 添加不同外源营养物对乙醇产量的影响47
• 3.2.9 发酵温度对乙醇产量的影响47
• 3.2.10混合基质配比对乙醇产量的影响47-48
• 3.3 结果与讨论48-53
• 3.3.1 预处理方式的选择48-49
• 3.3.2 物料湿度对乙醇产量的影响49-50
• 3.3.3 添加不同外源营养物对乙醇产量的影响50-51
• 3.3.4 发酵温度对乙醇产量的影响51-52
• 3.3.5 混合基质配比对乙醇产量的影响52-53
• 3.4 结论与展望53-54
• 3.4.1 本章结论53
• 3.4.2 展望53-54
• 第四章 P. chrysosporium菌株的诱变和ADH序列分析54-73
• 引言54
• 4.1 材料与方法54-57
• 4.1.1 材料54-55
• 4.1.2 实验方法55-57
• 4.2 结果与讨论57-71
• 4.2.1 紫外诱变致死率曲线57-58
• 4.2.2 诱变后培养与优势菌的筛选58-59
• 4.2.3 诱变菌株发酵玉米秸秆验证乙醇产量59-61
• 4.2.4 诱变菌株的稳定性61-62
• 4.2.5 P. chrysosporium突变株ADH基因的克隆与序列分析62-71
• 4.3 结论与展望71-73
• 4.3.1 本章结论71
• 4.3.2 展望71-73
• 参考文献73-83
• 致谢83-85
• 攻读学位期间发表的学术论文目录85-86

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