玉米秸秆为原料燃料乙醇制备的关键问题研究

【摘要】： 木质纤维素是地球上最丰富、最廉价的可再生资源,被认为是最重要的乙醇生产的后续资源物质。但在以木质纤维素为原料进行乙醇制备方面仍存在原料预处理技术难、纤维素酶水解成本高和木糖尚无法被利用产酒精等问题,纤维素乙醇的价格尚无法与粮食乙醇竞争,解决纤维素乙醇制备过程中的关键技术已成为全世界共识。本论文针对目前制约木质纤维素物质生产乙醇的主要技术瓶颈,在原料预处理、纤维素降解菌群在纤维素酒精生产中的应用和木糖利用方面进行以下研究: 根据微波加热的基本原理,结合预处理的目标和特点,将微波引入秸秆的预处理过程,对不同的吸波介质进行了比较和选择,确定水是对纤维素酶毒性最小、预处理效果较好且环保经济的吸波介质。优化出微波预处理玉米秸秆的工艺参数为液固比为58:1,微波功率为630 W,处理时间为5.5分钟,在该条件下,微波预处理玉米秸秆的酶解率可达到49.12%。应用原子力显微镜(AFM)观察微波水预处理前后的秸秆表面形貌,结合本研究中预处理前后秸秆成分的变化结果,发现微波预处理是利用水分子在秸秆表面“钻孔”从而增大秸秆与纤维素酶的接触面积,也使得纤维素酶容易进入秸秆内部进行水解从而达到提高酶解效率的目的。 从自然环境中分离筛选出高效产酶且酶活稳定的纤维素降解菌株FLZ6和FLZ10,采用形态学、生理生化和微生物细胞膜脂肪酸特异性分析,鉴定FLZ6为地衣芽孢杆菌(Bacillus-licheniformis),FLZ10为毛壳菌(Chaetomium spp)。应用FLZ6和FLZ10构建纤维素降解菌群代替纤维素酶使用,进行同时糖化发酵(SSF)生产乙醇的研究,通过测定反应体系中的乙醇含量,对SSF工艺进行了优化,最终确定了SSF工艺的最佳条件为:反应温度37℃,初始pH 6.0,纤维素降解菌群和酵母菌的比例为1:1,反应时间36小时。在该条件下,获得了13.1 g/100 g秸秆的乙醇。 从富含丰富的腐烂纤维素的土壤中分离筛选出一株木糖发酵酵母菌株FL-20-2。采用形态学、生理生化和分子生物学方法将这株菌鉴定为假丝酵母属中的热带假丝酵母(Candida tropicalis)。在确定最优发酵培养基组份(木糖50 g/L,酵母粉0.5 g/L,KH2PO4 2.5 g/L,MgSO4. 7H2O 0.4 g/L)的基础上,进行菌株代谢特性分析。发现FL20-2在以木糖为唯一碳源时,pH 5.5,温度35℃,接种量为10%的厌氧条件下培养96 h,乙醇产量最高,为其利用木糖生成乙醇理论产量的32.4%,此时伴有31.05 g/L的木糖醇生成。在以木糖和葡萄糖的混合糖为碳源时,相同发酵条件下,木糖和葡萄糖转化的乙醇产量分别为其理论产量的37.7%和79.2%,同时伴有30.2 g/L的木糖醇产生。采用纤维素降解菌群和热带假丝酵母混合,对经过微波预处理的玉米秸秆进行乙醇制备研究,在纤维素降解菌群和热带假丝酵母菌按体积比1:1,10%接种量,温度为40℃,时间84 h条件下,乙醇产量为17.9 g/100g玉米秸秆,同时伴有10.05 g/100 g玉米秸秆的木糖醇生成。 通过对假丝酵母菌属(Candida sp.)木糖还原酶基因序列保守区域的分析,设计了一系列引物,以近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)的总RNA为模板,采用RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)的方法成功获取了Candida parapsilosis木糖还原酶基因,其开放阅读框长度为954 bp,使用Blastn程序进行检索后发现与白色假丝酵母(Candida albicans)的醛糖还原酶(aldose reductase ,XM715658)同源性最高,相似性为80%,通过进化关系分析认定本文发现了一种新的木糖还原酶基因,其登录号为:EF033247。选用巴斯德毕赤酵母表达载体pGAPZαA为载体,将获得的木糖还原酶基因开放阅读框克隆该表达载体pGAP启动子下,构建分泌型重组质粒,该重组质粒同源重组到毕赤酵母基因组上进行稳定表达,表达产物采用镍离子亲和层析柱进行纯化,得到约36-kDa蛋白条带。酶学性质的分析表明,重组蛋白具有较高的木糖催化效率(kcat/Km = 61 /mM/min)和不同于其它木糖还原酶的辅酶特性,其依赖于NADH的催化效率(kcat/Km = 41.5 /μM/min)大于依赖于NADPH的催化效率(kcat/Km = 2.2 /μM/ min)。 本论文通过上述研究,基本确定了以玉米秸秆为原料进行乙醇制备的工艺过程,采用本论文的技术,可获得17.9 g乙醇/100g玉米秸秆这一较高的乙醇产量;同时通过对木糖利用关键酶-木糖还原酶的辅酶特性研究,有望解决木糖发酵乙醇途径中的辅酶不平衡问题,为提高木糖发酵生产酒精的产量,进而进一步增加玉米秸秆的乙醇产量奠定基础。 【关键词】：玉米秸秆 酒精 微波 混合纤维素降解菌群 木糖
【学位授予单位】：哈尔滨工业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：X712
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-16
• 第1章 绪论16-36
• 1.1 课题背景16-17
• 1.2 国内外燃料乙醇发展状况17-21
• 1.2.1 国外燃料乙醇发展状况17
• 1.2.2 我国燃料乙醇发展状况17-18
• 1.2.3 纤维素燃料乙醇发展状况18-21
• 1.3 秸秆类生物质生产乙醇的原理21-23
• 1.4 秸秆类生物质生产酒精关键技术的国内外研究与应用现状23-34
• 1.4.1 秸秆的预处理技术23-27
• 1.4.2 纤维素水解糖化技术27-29
• 1.4.3 纤维素酒精的生产发酵方式29-30
• 1.4.4 半纤维素生产酒精技术30-34
• 1.5 课题的研究意义与内容34-36
• 第2章 实验材料与方法36-48
• 2.1 实验仪器与设备36-37
• 2.2 实验材料37-38
• 2.2.1 玉米秸秆原料37
• 2.2.2 微生物和酶37
• 2.2.3 实验采用的培养基37-38
• 2.3 分析方法38-43
• 2.3.1 理化分析项目39
• 2.3.2 玉米秸秆分析39-40
• 2.3.3 糖化和发酵产物分析40-41
• 2.3.4 酶学性质分析41-43
• 2.4 微生物学分析项目和方法43-46
• 2.4.1 微生物形态学观察43
• 2.4.2 细菌的分析43-44
• 2.4.3 酵母菌的分析44-45
• 2.4.4 微生物细胞膜短链脂肪酸特异性分析45-46
• 2.5 分子生物学分析项目与方法46-48
• 2.5.1 细菌16SrDNA碱基序列测定与分析46-47
• 2.5.2 酵母菌26S rDNA D2 区碱基序列测定与分析47-48
• 第3章 玉米秸秆微波预处理技术的研究48-66
• 3.1 吸波介质对微波预处理的影响研究48-52
• 3.1.1 吸波介质对玉米秸秆pH的影响49-50
• 3.1.2 木质素、纤维素、半纤维素含量的影响50
• 3.1.3 吸波介质对酶解效率的影响50-51
• 3.1.4 吸波介质对纤维素酶毒性的影响51-52
• 3.1.5 吸波介质的确定52
• 3.2 微波/水玉米秸杆预处理工艺条件的研究52-60
• 3.2.1 响应曲面法简介52-53
• 3.2.2 微波/水玉米秸杆预处理工艺条件的优化53-60
• 3.3 微波预处理与汽爆预处理的比较60-61
• 3.4 微波预处理机理的初步探讨61-64
• 3.4.1 玉米秸秆的结构模型61-62
• 3.4.2 玉米秸秆的表面形貌62
• 3.4.3 微波预处理玉米秸杆的机理分析62-64
• 3.5 本章小结64-66
• 第4章 纤维素降解菌的筛选和同时糖化发酵生产乙醇实验研究66-86
• 4.1 纤维素降解菌的分离和筛选66-72
• 4.1.1 纤维素降解菌的分离纯化67
• 4.1.2 酒精生产用纤维素降解菌的筛选67-72
• 4.2 纤维素降解菌的鉴定72-78
• 4.2.1 纤维素降解菌的形态特征和培养特征72-73
• 4.2.2 纤维素降解菌的个体形态特征73-74
• 4.2.3 纤维素降解菌的生理生化实验74-77
• 4.2.4 纤维素降解菌细胞膜短链脂肪酸特异性77-78
• 4.3 纤维素降解菌产酶条件优化的研究78-80
• 4.4 同时糖化和发酵(SSF)生产酒精的工艺研究80-83
• 4.4.1 纤维素降解菌单菌株和复配菌株的SSF试验80-82
• 4.4.2 SSF工艺参数的优化82-83
• 4.5 纤维素降解菌群与纤维素酶糖化的比较83-84
• 4.6 本章小结84-86
• 第5章 木糖利用酵母菌的筛选及葡萄糖/木糖发酵性能研究86-106
• 5.1 木糖利用酵母菌的筛选86-89
• 5.1.1 木糖利用酵母菌的初筛87
• 5.1.2 木糖利用酵母菌的复筛87-89
• 5.2 木糖利用酵母菌的鉴定89-95
• 5.2.1 形态学特征89-90
• 5.2.2 生理生化学特征90-93
• 5.2.3 分子生物学鉴定93-95
• 5.3 木糖利用酵母菌的驯化95-97
• 5.3.1 酵母驯化用培养基级驯化过程96
• 5.3.2 驯化后菌株的发酵情况96-97
• 5.4 木糖利用酵母菌单木糖和混合糖（木糖/葡萄糖）发酵性能研究97-103
• 5.4.1 培养基成分优化97-98
• 5.4.2 发酵条件的优化98-101
• 5.4.3 木糖发酵性能的研究101-102
• 5.4.4 混合糖(葡萄糖/木糖)发酵性能的研究102-103
• 5.5 木糖利用酵母菌进行同时糖化发酵酒精制备的初步研究103-105
• 5.6 本章小结105-106
• 第6章 偏向依赖于辅酶NADH 的木糖还原酶基因克隆和酶学性质的研究106-132
• 6.1 木糖还原酶基因xy11 的获得107-114
• 6.1.1 RACE 实验的引物设计107-108
• 6.1.2 细胞培养及总RNA 的提取108
• 6.1.3 3? RACE 实验108-110
• 6.1.4 5?RACE 实验110-111
• 6.1.5 XYL1 基因全序列的获得与克隆111-114
• 6.1.6 进化关系分析114
• 6.2 木糖还原酶基因的亚克隆和初步表达114-124
• 6.2.1 限制性酶切反应116-117
• 6.2.2 片断与载体的连接117
• 6.2.3 大肠杆菌的转化和阳性克隆筛选117-118
• 6.2.4 重组载体的毕赤酵母的转化118-120
• 6.2.5 木糖还原酶基因重组蛋白的表达及重组蛋白的Western 印迹120-124
• 6.3 木糖还原酶(XR)酶学性质研究124-125
• 6.3.1 温度及pH 对XR 酶活力的影响124
• 6.3.2 XR 的底物专一性和辅酶特性124-125
• 6.4 木糖还原酶蛋白三维结构和与辅酶的分子对接研究125-128
• 6.4.1 木糖还原酶三位结构初建126
• 6.4.2 同源模型的修正126
• 6.4.3 木糖还原酶与辅酶的分子对接126-128
• 6.5 本章小结128-132
• 参考文献132-144
• 攻读学位期间发表的学术论文144-146
• 致谢146-147
• 个人简历147

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