利用酵母重组技术提高作物秸秆乙醇发酵的研究

【摘要】：我国是农作物种植大国,每年产生的农作物秸秆和其它农作物废弃物高达7亿吨以上。而种类多、数量巨大的农作物秸秆尚未进行大规模有效的开发利用,甚至被焚烧造成严重环境污染。利用这些丰富廉价的农作物秸秆可以代替粮食生产非粮燃料乙醇,其中甜高粱(Sorghum bicolor(L)Moench)是最有发展潜力的能源作物。甜高粱种质资源丰富,种植范围广,抗逆境能力强,茎秆产量高,茎汁含糖量高,同时也是生物量最高的作物之一。甜高粱作为生物质能源有很好的发展前景,其秸秆榨汁含糖量高,其榨汁和渣都可以生产乙醇。利用其秸秆渣水解物中的木糖发酵为乙醇才能提高作物秸秆纤维素乙醇的生产效益,同时降低农民的种植成本,构建高效代谢木糖的酿酒酵母(Sacc-haromyces cerevisiae)菌株,利用甜高粱等作物秸秆发酵燃料乙醇能缓解能源危机和保护环境。本研究以甜高粱秸秆为原材料,构建酿酒酵母工程菌,以甜高粱茎秆榨汁及渣混合原料进行同步糖化乙醇发酵并进行条件优化,提高甜高粱秸秆乙醇产量,为作物秸秆综合利用提供模式。1.对酿酒酵母T1308进行遗传背景分析,其5.8S rDNA-ITS序列与数据库中酿酒酵母序列同源性100%,确定该出发菌株为酵母;其子囊孢子美蓝染色及对MAT基因座序列分析,确定酵母为是杂合型二倍体(aα)。通过同源重组敲除其尿嘧啶合成酶关键基因URA3,获得尿嘧啶营养缺陷型菌株T1308-U。2.利用粳稻及真菌木糖异构酶基因构建木糖异构酶表达载体在酿酒酵母里获得表达,分析重组菌株木糖异构酶酶活,确定真菌木糖异构酶基因更适合在酵母里表达及其启动子。重组菌株木糖利用率分别是出发菌株的1.78-1.99倍,乙醇产率可达0.31g/g消耗糖。3.构建具有抗性标记kanMX和尿嘧啶合成酶基因URA3不同筛选标记的两种强启动子TPI的载体,并将启动子直接插入酿酒酵母的木酮糖激酶基因及非氧化磷酸戊糖途径(PPP)关键基因之前,再转入粳稻或真菌的木糖异构酶表达载体,获得的木糖代谢流增强的重组菌株,与出发菌株相比,重组菌株PXI-T1308-U转录水平上木酮糖激酶表达增强了4.08倍,磷酸戊糖途径非氧化阶段的磷酸戊酮糖差向异构酶、核糖-5-磷酸异构酶、转醛酶、转酮酶表达分别增强了4.17、17.36、1.62和3.98倍。木糖利用率比出发菌株提高了3.28倍,乙醇产率达到0.33g/g消耗糖。4.以甜高粱秸秆为原料,对其茎秆榨汁及渣同步糖化乙醇发酵工艺进行优化,按最优发酵条件,重组菌株发酵的乙醇浓度达到31.79g/L,这比单纯以甜高粱茎汁为原料发酵所得乙醇浓度提高了5.45g/L。本研究首次以甜高粱茎秆榨汁和渣为原料,并利用基因重组酵母厌氧条件下进行同步糖化乙醇发酵,并对甜高粱茎秆渣汁同步糖化发酵工艺进行优化。选择粳稻木糖异构酶基因及重组酵母构建等方面的研究具有应用前景,相关结果为促进甜高粱等能源作物的转化利用缓解能源危机及降低秸秆燃料乙醇的生产成本提供参考。 【关键词】：甜高粱(Sorghum bicolor(L)Moench) 酿酒酵母(Saccharomyces cer-evisiae) 木糖 木糖异构酶 乙醇发酵
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S216.2
【目录】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-13
• 第一章 文献综述13-32
• 1.1 研究背景13-14
• 1.1.1 世界和我国能源现状及未来发展趋势13
• 1.1.2 生物质能发展利用13-14
• 1.2 木质纤维素乙醇14-18
• 1.2.1 研究纤维素乙醇的意义15
• 1.2.2 国内外纤维素燃料乙醇的研究现状15-18
• 1.3 纤维素乙醇的原料预处理工艺18-21
• 1.3.1 木质纤维素原料的结构特征18-20
• 1.3.2 纤维素原料预处理的目的20
• 1.3.3 纤维素原料的预处理方法及特点20-21
• 1.4 甜高粱秸秆乙醇的优势21-23
• 1.4.1 甜高粱茎秆的固态乙醇发酵22
• 1.4.2 甜高粱茎秆榨汁的乙醇发酵22-23
• 1.5 木糖发酵菌株的研究进展23-30
• 1.5.1 大肠杆菌木糖发酵研究进展23
• 1.5.2 运动发酵单胞菌木糖发酵研究进展23-24
• 1.5.3 树干毕赤酵母木糖发酵研究进展24-25
• 1.5.4 酿酒酵母木糖发酵研究进展25-29
• 1.5.5 基因敲除技术在酵母代谢工程中的应用29-30
• 1.6 本论文研究内容及思路30-32
• 第二章 酿酒酵母T1308尿嘧啶营养缺陷型构建32-49
• 2.1 试验材料33
• 2.1.1 培养基33
• 2.1.2 主要试剂盒及生化试剂33
• 2.2 试验方法33-38
• 2.2.1 酿酒酵母T1308遗传背景分析33-35
• 2.2.2 酿酒酵母尿嘧啶营养缺陷型构建35-38
• 2.3 结果与分析38-46
• 2.3.1 ITS扩增片段及其序列比对分析38-39
• 2.3.2 酿酒酵母孢子染色分析39
• 2.3.3 酿酒酵母配型鉴定39-40
• 2.3.4 敲除组件的扩增及敲除组件1转化酵母40-43
• 2.3.5 敲除组件2转化酵母43-45
• 2.3.6 重组菌株T1308-U混合糖（葡萄糖和木糖）乙醇发酵45-46
• 2.4 讨论46-49
• 2.4.1 酵母倍性对酵母生理影响46-47
• 2.4.2 二倍体酵母基因敲除的应用及其对菌株的生理影响47-48
• 2.4.3 尿嘧啶营养缺陷型重组菌株生长及乙醇发酵能力48-49
• 第三章 木糖异构酶及其启动子的筛选49-66
• 3.1 材料49
• 3.2 试验方法49-52
• 3.2.1 酿酒酵母基因组DNA的提取49
• 3.2.2 琼脂糖凝胶中DNA片段的回收49-50
• 3.2.3 载体和片段连接50
• 3.2.4 大肠杆菌感受态细胞的制备和热击转化DNA50
• 3.2.5 酿酒酵母感受态细胞的制备及醋酸锂化学法转化DNA50
• 3.2.6 酿酒酵母胞内蛋白的提取50
• 3.2.7 蛋白质浓度测定方法50-51
• 3.2.8 重组菌株木糖异构酶酶活的测定51
• 3.2.9 重组菌的厌氧发酵51-52
• 3.2.10 酿酒酵母木糖异构酶组成型强表达载体构建路线52
• 3.3 结果与分析52-64
• 3.3.1 组成型表达载体的构建52-57
• 3.3.2 真菌Piromyces sp. E2木糖异构酶组成型表达载体的构建57-58
• 3.3.3 粳稻木糖异构酶组成型表达载体的构建58
• 3.3.4 木糖异构酶组成型表达载体转入酿酒酵母58-59
• 3.3.5 酿酒酵母重组菌株木糖异构酶的酶活测定59-60
• 3.3.6 重组酿酒酵母葡萄糖/木糖混合碳源厌氧发酵60-64
• 3.4 讨论64-66
• 3.4.1 增强基因表达的启动子选择64
• 3.4.2 粳稻及真菌木糖异构酶酶活分析64-65
• 3.4.3 重组菌株的木糖利用率65
• 3.4.4 木糖发酵乙醇的其它限制因素65-66
• 第四章 木糖代谢流增强重组酿酒酵母的构建及乙醇发酵66-88
• 4.1 材料66
• 4.2 试验方法66-69
• 4.2.1 酿酒酵母基因组DNA的提取66
• 4.2.2 琼脂糖凝胶中DNA片段的回收66
• 4.2.3 载体和片段连接66
• 4.2.4 大肠杆菌感受态细胞的制备和热击转化DNA66-67
• 4.2.5 酿酒酵母感受态细胞的制备及醋酸锂化学法转化DNA67
• 4.2.6 Real-time PCR67
• 4.2.7 基因整合增强表达的路线67-69
• 4.2.8 重组菌株葡萄糖及木糖混合发酵69
• 4.3 结果和分析69-86
• 4.3.1 基因整合增强载体的构建69-71
• 4.3.2 酿酒酵母XKS1、TAL1、RKI1、RPE1和TKL1基因同源重组整合片段的扩增71-72
• 4.3.3 同源重组整合片段整转入实验室单倍体菌株酿酒酵母CEN.PK.113-5D基因组72-75
• 4.3.4 同源重组整合片段转入二倍体酿酒酵母T1308-U基因组75-80
• 4.3.5 木糖异构酶表达载体转化重组酵母80
• 4.3.6 木酮糖激酶和磷酸戊糖途径关键酶转录水平80-84
• 4.3.7 重组酿酒酵母葡萄糖/木糖混合碳源厌氧发酵84-86
• 4.4 讨论86-88
• 4.4.1 过表达木酮糖激酶对木糖发酵的作用86
• 4.4.2 磷酸戊糖途径非氧化阶段的增强86-88
• 第五章 重组酵母甜高粱茎秆乙醇发酵研究88-101
• 5.1 材料88-89
• 5.1.1 原料及处理处理过程88-89
• 5.1.2 发酵菌株89
• 5.1.3 糖化酶89
• 5.2 方法89-92
• 5.2.1 茎渣糖化89
• 5.2.2 响应面法优化发酵条件提高甜高粱茎汁及茎渣混合同步糖化乙醇发酵89-92
• 5.2.3 甜高粱茎汁乙醇发酵92
• 5.3 试验结果与分析92-99
• 5.3.1 茎渣糖化结果92
• 5.3.2 使用Plackett-Burman筛选关键因素92-93
• 5.3.3 釆用最陡爬坡试验确定显著因素的优化区域93-94
• 5.3.4 响应面模拟和优化甜高粱茎汁茎渣混合发酵产量94-99
• 5.4 讨论99-101
• 全文结论101-102
• 参考文献102-116
• 附录116-120
• 致谢120-121
• 作者简介121

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