活性污泥中嗜甲烷菌多样性动态分析

【摘要】：嗜甲烷菌广泛存在于大多数环境中。是一类以甲烷作为唯一碳源和能源的革兰氏阴性菌。因其在全球碳循环中所担负的重要作用和在生物降解方面的巨大潜能而引起了微生物学家广泛的兴趣。嗜甲烷菌可分为两种类型—Ⅰ型和Ⅱ型。目前，国内外研究嗜甲烷菌对于有机污染物的生物降解和生物修复多集中在纯培养方面，但是纯培养只能视为人工构建的生物群落，自然界大部分参与生物修复的嗜甲烷菌无法被发现。本文通过直接提取活性污泥中微生物的基因，利用DGGE和RFLP方法对活性污泥中的微生物特别是嗜甲烷菌多样性和自然群落进行分析，初步了解活性污泥中微生物的生态情况，为更好的研究控制用于降解废水中有害物质的微生物打下了理论基础。 首先，比较了三种活性污泥总DNA的提取方法，即TENP法、高温裂解法和优化PEG法。通过提取量、纯度以及是否有利于后续分子操作等方面的比较，最终确立了使用优化PEG方法提取活性污泥中的微生物基因组，避免了纯化过程带来的DNA损失或丢失。 其次，采用DGGE法对两种活性污泥样品不同季节的微生物群落结构进行了比较。电泳图谱显示，两种污泥中微生物群落结构差别不大，在温度较高的夏季和初秋季节，微生物种类相对较多，随着季节变化，温度逐渐降低，微生物种类逐渐开始变少，但同时出现了一些在高温时未出现的菌群。而有一些菌在不同条件下却一直存在。通过UPGMA系统树分析发现，两种污泥分属于不同的基因簇，由此可以说明，两种污泥主要降解菌群不同。 然后，利用DGGE系统对一年的活性污泥样品中的Ⅰ型和Ⅱ型嗜甲烷菌16S rDNAV3可变区扩增片段进行电泳，从宏观上分析了嗜甲烷菌type Ⅰ和type Ⅱ两种类型在活性污泥中分布情况。DGGE图谱表明Ⅰ型菌和Ⅱ型菌分布具有很大的差异，Ⅰ型菌随时间和温度变化较大，Ⅱ型菌则变化不明显。每个时期的优势菌群差别不大。 最后，建立嗜甲烷菌16S rDNA文库并采用RFLP技术对插入16S rDNA片段的质粒进行限制性片段长度多念性分析。酶切结果初步揭示了嗜甲烷菌Ⅰ型比Ⅱ型种类更加丰富。随机选取部分克隆子进行测序，结果表明，在活性污泥中存在大量嗜甲烷菌，以及一些参与降解一碳和复合碳的细菌，这些菌株与嗜甲烷菌具有很高的同源性，同属于变形菌纲。根据序列建立活性污泥中嗜甲烷菌系统进化树，为进一步研究活性污泥中嗜甲烷菌的分离和功能基因的研究提供了理论基础。 【关键词】：活性污泥 嗜甲烷菌 变性梯度凝胶电泳(DGGE) 16S rDNA文库 限制性片段长度多态性(RFLP)
【学位授予单位】：大连理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2006
【分类号】：X703
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-11
• 引言11-12
• 1 文献综述12-24
• 1.1 碳循环中的嗜甲烷菌12-14
• 1.1.1 微生物在碳循环中的作用12
• 1.1.2 甲烷的循环12-13
• 1.1.3 甲烷氧化作用13-14
• 1.2 嗜甲烷菌简介14
• 1.3 嗜甲烷菌的分类14-17
• 1.3.1 基于形态学的分类情况14-15
• 1.3.2 基于16S rDNA的分类情况15-17
• 1.4 嗜甲烷菌的研究方法17-20
• 1.4.1 纯培养方法17
• 1.4.2 分子生物学研究方法17-20
• 1.5 嗜甲烷菌的生态分布20
• 1.6 研究意义及主要研究工作20-24
• 1.6.1 研究意义20-22
• 1.6.2 研究主要工作22-24
• 2 活性污泥总 DNA提取方法的确定24-31
• 引言24
• 2.1 材料与方法24-27
• 2.1.1 实验仪器24-25
• 2.1.2 实验试剂25
• 2.1.3 污泥样品的预处理25
• 2.1.4 活性污泥总 DNA的提取方法25-27
• 2.2 提取总 DNA质量检测27-28
• 2.2.1 基因组 DNA浓度测定和纯度鉴定27
• 2.2.2 PCR和凝胶电泳检测27-28
• 2.3 结果与分析28-29
• 2.3.1 提取方法的对比28-29
• 2.3.2 PCR扩增情况29
• 2.4 讨论29-31
• 3 活性污泥中微生物群落多样性鉴定31-38
• 引言31
• 3.1 材料与方法31-33
• 3.1.1 实验仪器31
• 3.1.2 实验试剂31-32
• 3.1.3 活性污泥样品的采集及保存32
• 3.1.4 活性污泥 DNA的提取32
• 3.1.5 细菌16S rDNAV3区的扩增32-33
• 3.1.6 PCR扩增产物的 DGGE分析33
• 3.2 结果与分析33-37
• 3.2.1 总染色体 DNA提取33-34
• 3.2.2 活性污泥中细菌16S rDNA V3区DGGE结果34-37
• 3.3 讨论37-38
• 4 嗜甲烷菌16S rDNA的变性梯度凝胶电泳分析38-49
• 引言38
• 4.1 材料与方法38
• 4.1.2 实验仪器38
• 4.1.2 实验试剂38
• 4.2 PCR产物的扩增38-40
• 4.2.1 嗜甲烷菌16S rDNA基因的扩增38-39
• 4.2.2 嗜甲烷菌16S rDNA片断 V3区扩增反应条件39-40
• 4.3 变性梯度凝胶电泳检测嗜甲烷菌I型和II型多样性40-41
• 4.3.1 嗜甲烷菌16S rDNA的V3区变性梯度凝胶电泳40
• 4.3.2 对 DGGE图谱进行分析40-41
• 4.4 结果与分析41-47
• 4.4.1 嗜甲烷菌16S rDNA扩增结果41
• 4.4.1 嗜甲烷菌 I型多样性分析41-44
• 4.4.2 嗜甲烷菌 II型多样性分析44-47
• 4.5 讨论47-49
• 5 嗜甲烷菌16S rDNA扩增片断的克隆与初步分析49-59
• 引言49
• 5.1 材料与方法49-50
• 5.1.1 取样地点49
• 5.1.2 实验仪器49-50
• 5.1.3 培养基、抗生素以及常用溶液的配制50
• 5.2 PCR产物的扩增50
• 5.3 PCR产物的检测及纯化50
• 5.4 感受态细胞的制备50-51
• 5.5 构建克隆质粒51
• 5.6 电转化感受态细胞51
• 5.7 提取质粒51
• 5.8 质粒的 ARDRA分析51-52
• 5.8.1 限制性内切酶酶切51-52
• 5.8.2 酶切产物的电泳分析52
• 5.8.3 文库指标分析52
• 5.9 序列测定52
• 5.10 系统发育分析52-53
• 5.11 结果与分析53-56
• 5.11.1 重组质粒转化感受态细胞53
• 5.11.2 文库的 RFLP酶切图谱分析53-55
• 5.11.3 文库分析55-56
• 5.12 讨论56-59
• 结论59-60
• 参考文献60-65
• 附录A 部分嗜甲烷菌typeI的16S rDNA序列65-68
• 附录B 部分嗜甲烷菌typeII的16S rDNA序列68-70
• 攻读硕士学位期间发表学术论文情况70-71
• 致谢71-72
• 大连理工大学学位论文版权使用授权书72

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