甲烷氧化菌的高密度培养

【摘要】：甲烷氧化菌和甲烷单加氧酶作为重要的多功能微生物催化剂,应用潜力巨大,受到众多研究机构的关注。充分发挥甲烷氧化菌的作用,不仅可防治温室气体之害,还可获取洁净能源、塑料物质、新型食品抗氧化剂、单细胞蛋白等,同时在污染治理方面(如三氯乙烯降解)也显示出巨大的潜力。但由于甲烷氧化菌细胞生长速度慢、细胞密度低、发酵周期长,导致其在工业应用中不能满足大规模生产的需要。本项目的研究内容,构建和完善甲烷氧化菌的快速、高密度培养体系。尝试利用改变甲烷氧化菌的培养条件,.改变培养基中各物质的添加量来确定其最佳工艺条件。甲烷氧化菌的高密度培养体系除了可以加速其在工业生物催化中的应用,也必将提高甲烷氧化菌在环境甲烷控制应用中的能力。 建立以甲烷为碳源的细胞培养机制,建立起一整套的测定细胞干重、生长速率、延滞期、甲烷氧化菌的甲烷单加氧酶(MMO)活性的方法。采用甲烷与甲醇共同作为碳源培养菌体,并加入甲烷传递体使甲烷更易于溶于细胞内,缩短延滞期,提高了发酵液的细胞密度和细胞的MMO活性。结果表明Methylosinus trichosporium 3011高密度培养的最佳条件如下Cu2+浓度为30μmol/L,甲醇的添加量为0.05%(V/V),石蜡油的添加量为2.5%(V/V)。此时细胞生长最好,生长速率为0.0460h-1,OD600值为1.827,细胞密度最高,细胞干重可以达到1.224gL-1,是未添加的6陪,其延滞期缩短,活性也有所提高。建立起以Dianion HP20大孔树脂吸附、60%乙醇洗脱从发酵液中分离纯化甲烷氧化菌素(methanobactin)的方法。将Methylosinus trichosporium3011提纯出的methanobactin(无Cu)加入到含有30μmol/LCu2+的Methylosinus trichosporiu3011、Methylococcus capsulatus 3021、Methylosinus trichosporium OB3b和GYJ3的菌液中可影响它们的生长状况,如：代时缩短,最终细胞浓度变大,生长速度加快。其活性也都有所增加,methanobactin使Cu进入了细胞内,调控使pMMO表达量变大,增加了MMO的环氧化能力。 【关键词】：甲烷氧化菌 甲烷单加氧酶 高密度培养 甲烷传递体 甲烷氧化菌素
【学位授予单位】：哈尔滨商业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：TQ221.11
【目录】：

• 摘要5-6
• Abstract6-10
• 第1章 绪论10-17
• 1.1 甲烷10
• 1.2 甲烷氧化菌10-12
• 1.3 甲烷单加氧酶的结构与调控12-13
• 1.3.1 MMO的结构12-13
• 1.3.2 MMO的调控13
• 1.4 甲烷氧化菌及甲烷单加氧酶的应用13-14
• 1.5 甲烷氧化菌培养的研究现状14-15
• 1.6 本课题来源、研究意义及内容15-17
• 1.6.1 课题来源、研究意义15
• 1.6.2 本课题研究内容15-17
• 第2章 甲醇为碳源对甲烷氧化菌生长的影响17-29
• 2.1 引言17
• 2.2 实验材料与仪器17-18
• 2.2.1 实验材料17
• 2.2.2 主要实验仪器17-18
• 2.3 实验方法18-21
• 2.3.1 培养基配方18
• 2.3.2 甲烷为碳源的细胞培养方法的建立18-19
• 2.3.3 甲烷氧化菌的甲醇驯化培养19
• 2.3.4 甲醇为碳源的细胞发酵罐培养19-20
• 2.3.5 确定甲醇的最佳添加量20
• 2.3.6 甲醇添加时间的确定20
• 2.3.7 甲醇为碳源时细胞的生长与MMO活性20
• 2.3.8 发酵液中的甲醇含量与MMO活性的测定方法20-21
• 2.3.9 数据分析方式21
• 2.4 数据结果与分析21-27
• 2.4.1 甲烷为碳源的细胞生长状况21-22
• 2.4.2 不同浓度甲醇为碳源对IMV3011生长的影响22
• 2.4.3 不同浓度甲醇为碳源对IMV3011生长延滞期的影响22-24
• 2.4.4 甲醇消耗状况24
• 2.4.5 显微镜观察24-25
• 2.4.6 气相色谱测定MMO活性25-26
• 2.4.7 甲烷发酵体系中的酶活情况26-27
• 2.4.8 甲醇发酵体系中的酶活情况 #]827
• 2.5 本章小结27-29
• 第3章 铜离子含量对甲烷氧化菌生长的影响29-35
• 3.1 引言29
• 3.2 实验器材与仪器29-30
• 3.2.1 实验材料29
• 3.2.2 主要实验仪器29-30
• 3.3 实验方法30-31
• 3.3.1 培养基配方30
• 3.3.2 确定铜离子的最佳添加量30-31
• 3.3.3 细胞MMO活性的测定31
• 3.3.4 数据分析方式31
• 3.4 数据结果与分析31-34
• 3.4.1 不同浓度铜离子对IMV3011生长的影响31-32
• 3.4.2 不同浓度铜离子对IMV3011细胞生长延滞期的影响32-33
• 3.4.3 不同铜离子浓度对IMV3011MMO活性及细胞干重的影响33-34
• 3.5 本章小结34-35
• 第4章 甲烷传递体对甲烷氧化菌生长影响的研究35-43
• 4.1 引言35
• 4.2 实验器材与仪器35-36
• 4.2.1 实验材料35-36
• 4.2.2 主要实验仪器36
• 4.3 实验方法36-38
• 4.3.1 培养基配方36-37
• 4.3.2 确定甲烷传递体的最佳添加量37
• 4.3.3 细胞MMO活性的测定37
• 4.3.4 数据分析方式37-38
• 4.4 数据结果与分析38-41
• 4.4.1 不同浓度的甲烷传递体对IMV3011生长的影响38
• 4.4.2 不同浓度的甲烷传递体对IMV3011生长延滞期的影响38-40
• 4.4.3 不同浓度的甲烷传递体对IMV3011MMO活性及干重的影响40
• 4.4.4 甲醇和甲烷传递体共同对IMV3011生长的影响40-41
• 4.5 本章小结41-43
• 第5章 甲烷氧化菌素对甲烷氧化菌生长影响的研究43-55
• 5.1 引言43
• 5.2 实验器材与仪器43-44
• 5.2.1 实验材料43-44
• 5.2.2 主要实验仪器44
• 5.3 实验方法44-48
• 5.3.1 培养基配方44-46
• 5.3.2 甲烷氧化菌素的制取流程46-47
• 5.3.3 甲烷氧化菌素的检测47
• 5.3.4 添加Mb、Cu~(2+)对甲烷氧化菌生长的影响47
• 5.3.5 Mb、Cu~(2+)对甲烷氧化菌pMMO活性影响的研究47-48
• 5.3.6 细胞MMO活性的测定48
• 5.3.7 数据分析方式48
• 5.4 结果与分析48-54
• 5.4.1 甲烷氧化菌素冻干成品48-49
• 5.4.2 Mb冻干品全波长紫外扫描图谱49
• 5.4.3 甲烷氧化菌素的HPLC分析49-50
• 5.4.4 Mb、Cu~(2+)对IMV3011生长的影响50-51
• 5.4.5 Mb、Cu~(2+)对IMV3021生长的影响51-52
• 5.4.6 Mb、Cu~(2+)对GYJ3生长的影响52
• 5.4.7 Mb、Cu~(2+)对OB3b生长的影响52-53
• 5.4.8 Mb、Cu~(2+)对甲烷氧化菌pMMO活性影响53-54
• 5.5 本章小结54-55
• 结论55-57
• 参考文献57-61
• 攻读学位期间发表的学术论文61-62
• 致谢62

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