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有谁做过膳食纤维的测定,能不能告诉我实验室可行的具体测定步骤和注意事项?

来源:江南娱乐-意甲尤文图斯亚
时间:2024-08-17 10:56:06
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有谁做过膳食纤维的测定,能不能告诉我实验室可行的具体测定步骤和注意事项?【专家解说】:酶-重量法
1.原理:
样品分别用α-淀粉酶、蛋白酶、葡萄糖苷酶进行酶解消化以去除蛋白质和

【专家解说】:酶-重量法 1.原理: 样品分别用α-淀粉酶、蛋白酶、葡萄糖苷酶进行酶解消化以去除蛋白质和可消化的淀粉。总膳食纤维(TDF)是先酶解,然后用乙醇沉淀,再将沉淀物过滤,将TDF残渣用乙醇和丙酮冲洗,干燥称重。不溶性和可溶性膳食纤维(IDF和SDF)是酶解后将IDF过滤,过滤后的残渣用热水冲洗,经干燥后称重。SDF是将上述滤出液用4倍量的95%乙醇沉淀,然后再过滤,干燥,称重。 TDF、IDF和SDF量通过蛋白质、灰分含量进行校正。 2.适用范围 AOAC991.43 本方法适用于各类植物性食物和保健食品。 3.仪器 3.1烧杯:400或600ml高脚型。 3.2 过滤用坩埚:玻料滤板,美国试验和材料学会(ASTM)40-60μm,Pyrex 60ml(Corning No.36060 buchner,或同等的)。如下处理: (1) 在灰化炉525℃灰化过夜。炉温降至130℃以下取出坩埚。 (2) 用真空装置移出硅藻土和灰质。 (3) 室温下用2%清洗溶液浸泡1小时。 (4) 用水和去离子水冲洗坩埚;然后用15ml丙酮冲洗然后风干。 (5) 在干燥的坩埚中加0.5g硅藻土,在130℃烘干恒重。 (6) 在干燥器中冷却1小时,记录坩埚加硅藻土重量,精确至0.1mg。 3.3 真空装置: (1) 真空泵或抽气机作为控制装置。 (2) 1L的厚壁抽滤瓶。 (3) 与抽滤瓶相配套的橡皮圈。 3.4振荡水浴箱: (1) 自动控温使温度能保持在98±2℃。 (2) 恒温控制在60℃。 3.5 天平:分析级,精确至±0.1mg。 3.6马福炉:温度控制在525±5℃。 3.7干燥箱:温度控制在105和130±3℃。 3.8干燥器:用二氧化硅或同等的干燥剂。干燥剂两周一次在130℃烘干过夜。 3.9 PH计:注意温控,用pH4.0、7.0和10.0缓冲液标化。 3.10 移液管及套头:容量100μl和5ml。 3.11 分配器或量筒: (1) 15±0.5ml,供分配78%的乙醇,95%的乙醇以及丙酮。 (2) 40±0.5ml,供分配缓冲液。 3.12. 磁力搅拌器和搅拌棒。 4. 试剂 全过程使用去离子水,试剂不加说明均为分析纯试剂 4.1 乙醇溶液: (1) 85%:加895ml95%乙醇在1L量筒中,用水稀释至刻度。 (2) 78%:加821ml95%乙醇在1L量筒中,用水稀释至刻度。 4.2 丙酮: 4.3 供分析用酶:在0-5℃下储存。 (1) 热稳定α-淀粉酶溶液:Cat. No. A3306,Sigma Chemical Co.,St. Louis,MO63178,或 Termamyl 300L,Cat. No. 361-6282,Novo-Nordisk,Bagsvaerd,Denmark,或等效的酶。 (2) 蛋白酶:Cat. No. P3910,Sigma Chemical Co.,或等效的。当天用MES/TRIS缓冲液中现配50mg/ml酶溶液。 (3) 淀粉葡糖苷酶溶液:Cat. No. AMG A9913,Sigma Chemical Co.,或等效的。 4.4 硅藻土:酸洗(Celite 545 AW,No.C8656,Sigma Chemical Co.,或等效的)。 4.5 洗涤液:两者挑一。 (1) 铬酸:120g重铬酸钠Na2Cr2O7·2H2O,1000ml蒸馏水和1600ml浓硫酸。 (2) 实验室用液体清洁剂,预备急需清洗的(Micro,International Products Corp.,Trenton,NJ08016,或等效的)。用水配制2%溶液。 4.6 MES-TRIS缓冲液:0.05mol/L,温度在24℃时pH值为8.2。 (1) MES:2-(N-吗啉代)磺酸基乙烷(No.M-8250,Sigma Chemical Co.或等效的)。 (2) TRIS:三羟(羟甲基)氨基甲烷(No.T-1503,Sigma Chemical Co.或等效的)。 在1.7L的蒸馏水中溶解19.52gMES和12.2gTRIS,用6mol/L NaOH调pH到8.2,用水定容至2L。(注意:24℃时的pH为8.2,但是,如果缓冲液温度在20℃,pH就为8.3,如果温度在28℃,pH为8.1。为了使温度在20-28℃之间,需根据温度调整pH值。) 4.7 盐酸溶液:0.561mol//L,加93.5ml6mol/L盐酸到700ml水中,用水定容至1L。 5. 操作方法 5.1. 样品制备: (1) 固体样品:如果样品粒度>0.5mm,研磨后过0.3-0.5mm(40-60目)筛。 (2) 高脂肪样品:如果脂肪含量>10%,用石油醚去脂。每克样品用25ml,每次提取完静置一会儿再小心将烧杯倾斜,慢慢将石油醚倒出,共洗三次。 (3) 高碳水化合物样品:如果样品干重含糖>50%,用85%乙醇去除糖份,每克样品每次10ml,共洗三次轻轻倒出,然后在40℃烘箱中不时翻搅干燥过夜,并研磨过0.5mm筛。 5.2. 样品消化 (1) 准确称取双份1.000±0.005g样品(M1和M2),置于高脚烧杯中。 (2) 在每个烧杯中加入40ml MES-TRIS缓冲液,在磁力搅拌器上搅拌直到样品完全分散。(防止团块形成,使受试物与酶能充分接触)。 (3) 用热稳定的淀粉酶进行酶解处理:加100μl热稳定的淀粉酶溶液,低速搅拌。用铝箔片将烧杯盖住,在95-100℃水浴中反应30分钟。( 起始的水浴温度应达到95℃)。 (4) 冷却:所有烧杯从水浴中移出,凉至60℃。打开铝箔盖,用刮勺将烧杯边缘的网状物以及烧杯底部的胶状物刮离,以使样品能够完全的酶解。用10ml蒸馏水冲洗烧杯壁和刮勺。 (5) 用蛋白酶进行酶解处理:在每个烧杯中各加入100μl蛋白酶溶液。用铝箔盖住,在60℃持续摇动反应30分钟(开始时的水浴温度应达60℃),使之充分反应。 (6) pH值测定:30分钟后,打开铝箔盖,搅拌中加入5ml0.561mol/L HCL至烧杯中。60℃时用1mol/L NaOH溶液或1mol/L HCL溶液调最终pH为4.0-4.7。(注意:当溶液为60℃时检测和调整pH,因为在较低温度时pH会偏高。) (7) 用淀粉葡糖苷酶溶液酶解处理:搅拌同时加100μl淀粉葡糖苷酶溶液。用铝箔盖住,在60℃持续振摇反应30分钟,温度应恒定在60℃。 5.3 测定 5.3.1.总的膳食纤维测定 (1) 用乙醇沉淀膳食纤维:在每份样品中,加入预热至60℃的95%乙醇225ml,乙醇与样品的体积比为4∶1。 室温下沉淀1小时。 (2) 过滤装置:用15ml78%乙醇将硅藻土湿润和重新分布在已称重的坩埚中。用适度的抽力把坩埚中的硅藻土吸到玻板上。 (3) 酶解过滤,用78%乙醇和刮勺转移所有内容物微粒到坩埚中。(注意:如果一些样品形成胶质,用刮勺破坏表面,以加速过滤。) (4) 抽真空,分别用15ml的78%乙醇,95%乙醇和丙酮冲洗残渣各2次,将坩埚内的残渣抽干后在105℃烘干过夜。将坩埚置干燥器中冷却至室温。坩埚重量,包括膳食纤维残渣和硅藻土,精确称至0.1mg。减去坩埚和硅藻土的干重,计算残渣重。 (5) 蛋白质和灰分的测定:取成对的样品中的一份测定蛋白质,用 本书前述或GB-960.52方法测定。用(N×6.25作为蛋白质的转换系数)。 分析灰分时用平行样的第二份在525℃灼烧5小时,在干燥器中冷却,精确称至0.1mg,减去坩埚和硅藻土的重量,即为灰分重量。 5.3.2 .不溶性膳食纤维测定: (1) 称适量样品按5.2进行酶解,过滤前用3ml水湿润和重新分布硅藻土在预先处理好的坩埚上,保持抽气使坩埚中的硅藻土抽成均匀的一层。 (2) 过滤并冲洗烧杯,用10ml70℃水洗残渣2次,然后再过滤并用水洗,转移到600ml高脚烧杯,保留用以测定可溶性膳食纤维,按5.3.3。 (3) 用抽滤装置,分别用15ml78%乙醇,95%乙醇和丙酮各冲洗残渣2次。 (注意:应及时用78%乙醇、95%乙醇和丙酮冲洗残渣否则可造成不溶性膳食纤维数值的增大。) (4)按5.3.1.5用双份样品测定蛋白质和灰分。 5.3.3.可溶性膳食纤维测定: (1) 将不溶性膳食纤维过滤后的滤液收集到600ml高脚烧杯中,对比烧杯和滤过液,估计容积。 (2) 加约滤出液4倍量已预热至60℃的95%乙醇。或者将滤液和洗过残渣的蒸馏水的混合液调至80g,再加入预热至60℃的95%乙醇320ml。 (3) 室温下沉淀1小时。下面按5.3.1测定总膳食纤维,从"湿润和重新分布硅藻土……"。 6. 计算 TDF、IDF、SDF均用同一公式计算 膳食纤维(DF,g/100g)测定: DF={[(R1+R2)/2]-P-A}/[(M1+M2)/2]×100 式中:R1和R2=双份样品残留物重量(mg) P和A=分别为蛋白质和灰分重量(mg) M1和M2=样品重量(mg)
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