重组酿酒酵母乙醇高产菌株的构建及清洁发酵工艺研究

【摘要】： 能源匮乏的日益加剧和温室效应对全球气候造成的影响,使得人们越来越关注利用生物质材料生产替代能源乙醇的研究。利用酿酒酵母发酵生产乙醇是当前应用非常广泛的乙醇生产方法。为了获得乙醇产量提高的菌株,本文作者在本实验室他人工作的基础上,进一步通过分子生物学手段构建基因工程菌株。通过比较,挑选出性能优良的KZ4-D菌株进行发酵性能的考察以及工艺条件的摸索。 为了进一步引导酿酒酵母中的铵代谢流向利用NADH的谷氨酸途径,本论文中将原有工程菌株中的GDH1基因进行缺失,并通过交配和等位基因分离等手段获得一系列GDH1基因缺失的工程菌株。通过对这些菌株生长代谢情况的考查我们发现,已经过量表达GLT1基因的菌株中,GDH1基因缺失后,甘油产量降低,乙醇产量提高,乙酸产量有所提高,说明铵代谢进一步消耗了NADH。 为了得到适于工业生产的基因工程菌株,我们在对现有菌株进行比较分析后选择KZ4 (Mat a URA3- fps1Δ::repeat gpd2Δ::repeat GLT1-PGK1)作为重点考察对象。将KZ4菌株通过标记基因恢复和交配手段得到双倍体菌株KZ4-D。当接种量控制为初始OD660为2.0时,可以满足KZ4-D菌株的发酵要求,其乙醇产量比野生型菌株CK-D提高了3.1%。 本文中研究了利用玉米糖化清液进行发酵的工艺。实验数据显示,利用玉米清液发酵,比传统的带渣发酵具有更多优势。例如,酶的用量降低,生产更稳定,管路阻塞减少,最重要的是乙醇产量和单位体积的生产能力分别提高了2.56%和28%。 在一系列实验数据的基础上,我们建立了清液发酵过程的动力学模型,用logistic方程对菌体生长进行拟合,用Luedcking-Piret方程对乙醇形成进行拟合,用Luedeking-Piret-like方程对基质消耗进行模拟,都取得了较好的效果。为了进一步提高乙醇产量,我们利用统计学方法对清液发酵条件进行优化处理,确定了摇瓶实验中清液发酵的最优化条件为:(NH4)2HPO4 1.094g/L,(NH4)2SO4 0.2 g/L,MgSO4·7H2O,KH2PO4 0.5 g/L,CaCl2·2H2O 0.01 g/L,温度为33.6℃,初始pH5.0,转速为110r/min。经优化后,KZ4-D的乙醇产量比优化前提高了1.83%。 【关键词】：酿酒酵母 乙醇 清液发酵 动力学模型 Plackett-Burman设计 响应曲面法
【学位授予单位】：天津大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：TQ223.122
【目录】：

• 中文摘要3-4
• ABSTRACT4-6
• 目录6-10
• 第一章 文献综述10-27
• 1.1 乙醇的国内外发展状况和发展前景10-12
• 1.1.1 国外乙醇发展状况10-11
• 1.1.2 我国的乙醇发展状况11-12
• 1.2 发酵法生产乙醇的研究12-17
• 1.2.1 发酵法生产乙醇的原料12
• 1.2.2 发酵法生产乙醇的工艺12-16
• 1.2.2.1 干碾法与湿碾法12-14
• 1.2.2.2 浓醪发酵14-16
• 1.2.3 酿酒酵母代谢工程研究16-17
• 1.3 酿酒酵母发酵乙醇的生物代谢机理17-21
• 1.3.1 乙醇发酵的代谢途径18
• 1.3.2 甘油生成的生理意义18-19
• 1.3.3 酿酒酵母中甘油的生成与运输19-20
• 1.3.4 酿酒酵母的铵代谢途径20-21
• 1.4 发酵过程的动力学研究21-22
• 1.5 发酵条件的优化研究22-25
• 1.5.1 发酵的影响因素22-24
• 1.5.2 发酵条件的优化方法24-25
• 1.6 选题背景以及研究内容25-27
• 第二章 实验材料与方法27-48
• 2.1 菌株与质粒27-28
• 2.2 药品与试剂28-31
• 2.3 培养基31-33
• 2.3.1 基因操作用培养基31-32
• 2.3.2 发酵用培养基32-33
• 2.4 主要仪器33-34
• 2.5 主要基因操作方法34-40
• 2.5.1 大肠杆菌感受态细胞的制备34-35
• 2.5.2 大肠杆菌的转化(CaC1_2 法)35
• 2.5.3 质粒的提取（CTAB 法）35
• 2.5.4 酵母染色体的快速分离35-36
• 2.5.5 酵母细胞的转化36
• 2.5.6 凝胶电泳法检测DNA36-37
• 2.5.7 DNA 的纯化37
• 2.5.8 DNA 连接反应37-38
• 2.5.9 酵母交配型的验证38-39
• 2.5.10 二倍体细胞的孢子形成以及四分体拆分39
• 2.5.11 3′-凹端的补平39-40
• 2.6 发酵过程的主要分析方法40-45
• 2.6.1 菌体生长量的检测40
• 2.6.2 还原糖测定40-41
• 2.6.3 总糖的测定41
• 2.6.4 甘油含量测定41
• 2.6.5 乙醇含量测定41-42
• 2.6.6 乙酸含量测定42-44
• 2.6.7 活菌计数方法44
• 2.6.8 细胞干重的测定44-45
• 2.6.9 CO_2测定45
• 2.7 玉米糖化液的制备方法45-46
• 2.8 种子培养与接种46-48
• 第三章 GDH1 基因缺失菌株的构建与发酵性能考查48-63
• 3.1 pUC18-RKUR质粒的构建48-51
• 3.1.1 Kl.URA3 基因的扩增49-50
• 3.1.2 载体的制备50
• 3.1.3 连接，构建质粒50-51
• 3.1.4 pUC18-RKUR质粒的应用51
• 3.2 GDH1 基因缺失菌株的构建51-56
• 3.2.1 所用质粒的构建51-54
• 3.2.2 Δgdh1 菌株的构建54-56
• 3.2.3 在工业菌株中过量表达 GLN1 基因56
• 3.3 GDH1 基因缺失菌株的发酵性能考查56-61
• 3.3.1 发酵条件56-57
• 3.3.2 结果与讨论57-61
• 3.4 本章小结61-63
• 第四章 双倍体基因工程菌株的构建及发酵性能考察63-79
• 4.1 双倍体菌株的构建63-67
• 4.1.1 交配型转换法构建双倍体63-65
• 4.1.2 杂交法构建双倍体65-67
• 4.2 双倍体菌株的发酵性能比较67-69
• 4.3 接种量对KZ4-D发酵性能的影响69-70
• 4.4 添加氨基酸对KZ4-D的影响70-72
• 4.5 KZ4-D 的乙醇抗性研究72-76
• 4.6 KZ4-D 在5L 发酵罐中的代谢情况76-78
• 4.7 本章小结78-79
• 第五章 清液发酵及其动力学研究79-92
• 5.1 清液发酵与传统发酵比较79-82
• 5.2 清液发酵的动力学特性82-87
• 5.2.1 菌体生长的动力学模型82-84
• 5.2.2 产物生成的动力学84-85
• 5.2.3 基质消耗的动力学模型85-87
• 5.3 清液发酵营养条件的确定87-91
• 5.4 本章小结91-92
• 第六章 乙醇高产重组菌株的发酵条件优化92-103
• 6.1 玉米面的选择92-94
• 6.2 液化酶和糖化酶的最佳条件的选择94-96
• 6.2.1 液化酶作用温度的考查94
• 6.2.2 液化酶添加量的影响94
• 6.2.3 底物pH 对液化酶作用的影响94-95
• 6.2.4 糖化酶作用温度的考查95
• 6.2.5 糖化酶添加量对糖化效果的影响95-96
• 6.2.6 底物pH 对糖化酶作用的影响96
• 6.3 发酵条件的优化96-102
• 6.3.1 Plackett-Burman 设计寻找重要因素97-98
• 6.3.2 响应曲面法考察重要因素98-102
• 6.3.3 优化条件的验证实验102
• 6.4 本章小结102-103
• 第七章 结论与展望103-105
• 7.1 结论103-104
• 7.2 创新点104
• 7.3 对今后工作的建议与展望104-105
• 参考文献105-115
• 发表论文和参加科研情况说明115-116
• 致谢116

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