“清洁”载体转化系统的建立与应用

【摘要】： 小麦(Triticum aestivum L.)是世界上最重要的农作物之一,成为遗传工程改造农艺性状的主要研究对象。遗传操作研究者一直致力于通过人工遗传操作获得稳定表达的具有优良遗传性状的转基因后代,并消除其生物安全性的潜在危险。基因枪介导转化方法成为小麦遗传工程中的主导手段,传统的基因枪遗传转化法是用完整的环形质粒直接轰击受体材料获得稳定遗传后代,其中质粒中的细菌载体框架序列不仅是多余的且可能通过同源重组导致目的基因在转基因后代中不稳定的遗传。本研究通过基因枪法直接将多个目的基因最小表达框同时插入不同基因型小麦基因组中,获得稳定遗传的转基因小麦植株。建立并优化了“清洁”载体转化系统,剔除了细菌载体框架序列,并将此技术用于重要农艺性状基因的转化。 首先,通过标记基因(gus)和选择基因(bar)的遗传转化建立优化“清洁”载体转化系统,分别将完整的环形质粒和无载体框架序列的线性基因表达框(启动子,开放阅读框及终止子)两种构型导入可再生的幼胚组织并获得稳定表达的转基因植株。相对于完整质粒,线性基因表达框进行的转化效率约高出一倍,Southern-blot分析均呈现出1-3条外源基因的杂交带,表现出相对简单的遗传整合方式。转基因表达分析表明基因表达框在转基因后代中稳定表达,并遵循孟德尔遗传法则进行遗传分离。然后,通过优化“清洁”载体转化系统的各项转化参数,有效地提高了遗传转化效率,研究表明线性基因同样有效地将多种不同的基因整合插入受体基因组;最后,将该“清洁”转化系统分别运用于两种高分子量麦谷蛋白亚基基因1Ax1和1Dx5的遗传转化,以多种不同基因型小麦受体获得稳定表达及低拷贝的转基因植株,提高其胚乳组织麦谷蛋白亚基含量,有效改善其面包品质,并为其市场化降低了潜在的安全隐患。 【关键词】：“清洁”转化系统 基因枪 基因表达框 转化效率 低拷贝 高分子量麦谷蛋白亚基 生物安全
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2006
【分类号】：S512.1
【目录】：

• 摘要4-5
• ABSTRACT5-9
• 1 绪论9-31
• 1.1 转基因植物生物安全性与转化单元的关系10-18
• 1.2 转基因植物生物安全性的研究现状18-22
• 1.3 转基因小麦的研究进展22-29
• 1.4 本文研究内容29-31
• 2 小麦“清洁”载体转化系统的建立31-72
• 2.1 绪言31
• 2.2 实验材料31-33
• 2.3 实验方法33-53
• 2.4 实验结果53-67
• 2.5 讨论67-70
• 2.6 本章小结70-72
• 3 小麦HMW-GS 基因1AX1 的“清洁”载体遗传操作72-91
• 3.1 绪言72-73
• 3.2 实验材料73-74
• 3.3 实验方法74-79
• 3.4 实验结果79-88
• 3.5 讨论88-90
• 3.6 本章小结90-91
• 4 小麦HMW-GS 基因1DX5 的“清洁”载体遗传操作91-100
• 4.1 绪言91
• 4.2 实验材料91-92
• 4.3 实验方法92-93
• 4.4 实验结果93-97
• 4.5 讨论97-99
• 4.6 本章小结99-100
• 5 全文总结100-104
• 5.1 主要研究结果100-102
• 5.2 本文的特色与创新102-103
• 5.3 有待继续开展的工作103-104
• 致谢104-117
• 附录1 攻读学位期间发表的论文目录117-118
• 附录2 主要符号与缩略词表118

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