甘肃省农村户用沼气池及其发酵原料微生物群落结构的研究

【摘要】：人类对能源的需求日益增长,传统的化石能源却迅速减少,沼气技术是我国应对农村能源危机和环境污染等问题的有效途径。沼气发酵过程由细菌和产甲烷古菌的互养合作催化完成,微生物群落结构知识的匮乏直接阻碍了工程和工艺的改进进程,致使农村沼气系统运行效率低、可控性差及“越冬难”等问题难以解决。因此,研究沼气池及其发酵原料中微生物群落组成不仅具有理论意义,更具有巨大的经济效益。目前,嗜中温沼气池产甲烷菌多样性已得到广泛研究,但是对于低温沼气池以及发酵原料中细菌和古菌群落结构的研究却很少。本研究利用16S-rDNA克隆文库的分子生物学方法对甘肃临夏以猪粪、牛粪为主要发酵底物的嗜中温(夏季)和低温(冬季)农村户用沼气池及其粪便原料中的微生物群落结构进行研究。主要研究结果如下：1.揭示了中、低温农村户用沼气池的微生物多样性和群落结构。在12个沼气池中共检测到353个细菌类群(隶属于14个门)和20个古菌类群(隶属于6个属)；优势类群分别为Methanomicrobiales(古菌)和Firmicutes、Bacteroides、 Proteobacteria(细菌)。结果表明农村户用沼气发酵系统微生物种类非常丰富,细菌多样性高于古菌。相似性指数(Jaccard index;细菌：0.15-0.31,古菌：0.01-0.50)和主成分(PCA)的分析结果说明不同沼气池的微生物群落结构和多样性存在明显差异。2.分析了低温与中温沼气池、猪粪池与牛粪池产甲烷功能菌群结构,发现它们的优势菌群差异显著。耐寒菌Methanogenium和Methanocorpusculum的丰度在低温沼气池中明显高于嗜中温沼气池,而嗜中温菌属Methanoplanus的丰度在嗜中温沼气池中明显高于低温沼气池；猪粪池中以Methanocorpusculum为绝对优势菌群,而牛粪池的古菌类群分布则较为均匀。3.阐释了农村户用沼气池的主要甲烷代谢途径。各沼气池优势产甲烷菌群均为氢营养型的甲烷微菌目成员,因此,氢依赖型甲烷合成通路为主要的甲烷代谢途径。4.了解了单阶段农村户用沼气池中关键微生物菌群的相互作用。纤维素、蛋白质和脂肪酸等复杂有机物的降解主要由Firmicutes、Bacteroides等细菌完成,酸化作用主要由Proteobacteria和Synergistetes等类群完成：产甲烷作用主要由Methanomicrobiales成员完成。5.研究了中、低温条件下猪粪和牛粪的微生物多样性和群落结构。4个粪便样品中共检测到290个细菌类群(隶属于11个门)和13个古菌类群(隶属于5个属)。优势类群分别为Methanomicrobiales(古菌)和Firmicutes、Bacteroides、 Proteobacteria(细菌)。结果表明猪粪和牛粪中微生物种类丰富,细菌多样性高于古菌,猪粪微生物多样性高于牛粪。Jaccard index(细菌：0.12-0.24,古菌：0.33-0.55)和PCA结果说明不同粪便的微生物群落结构和多样性存在明显差异。6.系统发育结果表明猪粪和牛粪中某些细菌类群呈现出相似的温度(季节)差异性。β-、γ-、δ-、ε-Proteobacteria、Verrucomicrobia、Chloroflexi的类群丰度低温大于中温,Firmicutes、Bacteroidetes、Lentisphaerae、Tenericutes的类群丰度中温大于低温。7.揭示了沼气池与其粪便底物微生物群落的相关性。首先,沼气池的微生物群落主要源于其粪便底物,二者具有相似的群落结构和相同的优势类群；其次,二者在细菌优势类群Firmicutes、Bacteroides和Proteobacteria的丰度上呈现相反的变化趋势,且粪便中存在绝对优势类群,沼气池中优势类群分布则趋于均匀化；再者,粪便中以降解纤维素的Firmicutes为主,沼气池中降解小分子化合物的Proteobacteria丰度明显上升,推测沼气发酵过程中对小分子化合物的降解比例明显升高。8.以粪便为主要发酵底物的农村户用沼气池有其独特的发酵特征。沼气池粪便底物比重较大故pH较高(7.92-8.26),池内温度(30-40℃)随环境温度呈现一定波动性；由此造成微生物活性降低、群落结构不稳定,发酵进程减缓,滞留时间延长(70-80天),最终导致产气不稳定产气量降低等现象。综上所述,本研究首次较全面的阐述了以猪粪、牛粪为主要底物的嗜中温和低温农村户用沼气池及其发酵原料中的微生物群落结构和多样性,揭示了沼气池与其发酵原料菌群结构的相关性,初步分析了沼气发酵主要功能菌群的相互作用等；为农村户用沼气发酵的推广和高效运行提供一定的理论基础。 【关键词】：农村户用沼气池 发酵底物 微生物多样性 群落结构 相互作用
【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：S216.4
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-10
• 第一章 前言10-19
• 1.1 研究背景10-11
• 1.2 沼气发酵基础概述11-13
• 1.2.1 厌氧消化的优点11-12
• 1.2.2 沼气发酵的基本原理12
• 1.2.3 沼气发酵的主要微生物及其相互作用12-13
• 1.3 国内外研究进展13-17
• 1.3.1 沼气发酵微生物多样性研究进展13-14
• 1.3.2 微生物分子生物学技术研究进展14-17
• 1.4 研究目的和意义17-19
• 第二章 材料与方法19-24
• 2.1 实验材料19-20
• 2.2 实验方法20-24
• 2.2.1 技术路线20-21
• 2.2.2 DNA提取21
• 2.2.3 16S-rDNA扩增、克隆文库构建及ARDRA分析21-22
• 2.2.4 测序及系统发育分析22-23
• 2.2.5 统计学分析23-24
• 第三章 结果24-61
• 3.1 细菌及古菌16S-rDNA基因文库分析24-26
• 3.1.1 微生物基因组DNA分析24
• 3.1.2 16S-rDNA基因的PCR扩增分析24-25
• 3.1.3 16S-rDNA基因克隆分析25
• 3.1.4 克隆文库的ARDRA分析25-26
• 3.2 沼气池细菌群落结构和多样性26-38
• 3.2.1 库容分析26-27
• 3.2.2 细菌16S-rDNA基因系统发育分析27-34
• 3.2.3 不同沼气池细菌群落结构比较分析34-36
• 3.2.4 沼气池细菌多样性分析36-37
• 3.2.5 沼气池细菌群落组成的相似性分析37-38
• 3.3 沼气池古菌群落结构和多样性38-45
• 3.3.1 库容分析38-39
• 3.3.2 古菌16S-rDNA基因系统发育分析39-42
• 3.3.3 不同沼气池古菌群落结构比较分析42-44
• 3.3.4 沼气池古菌多样性分析44
• 3.3.5 沼气池古菌群落组成的相似性分析44-45
• 3.4 猪粪和牛粪中细菌群落结构和多样性45-54
• 3.4.1 库容分析45-46
• 3.4.2 细菌16S-rDNA基因系统发育分析46-51
• 3.4.3 猪粪和牛粪细菌群落结构比较分析51-53
• 3.4.4 猪粪和牛粪细菌多样性分析53
• 3.4.5 猪粪和牛粪细菌群落组成的相似性分析53-54
• 3.5 猪粪和牛粪中古菌群落结构和多样性54-60
• 3.5.1 库容分析54-55
• 3.5.2 古菌16S-rDNA基因系统发育分析55-57
• 3.5.3 猪粪和牛粪古菌群落结构比较分析57-58
• 3.5.4 猪粪和牛粪古菌多样性分析58-59
• 3.5.5 猪粪和牛粪古菌群落组成的相似性分析59-60
• 3.6 沼气池参数与微生物群落结构比较分析60-61
• 第四章 讨论61-72
• 4.1 农村户用沼气池细菌群落结构分析61-64
• 4.1.1 沼气池细菌类群代谢特征分析61-63
• 4.1.2 不同沼气池细菌群落结构和多样性比较63-64
• 4.2 农村户用沼气池古菌群落结构分析64-68
• 4.2.1 产甲烷菌代谢特征分析64-65
• 4.2.2 不同沼气池古菌群落结构和多样性比较65-66
• 4.2.3 氢依赖型甲烷合成通路为沼气池中优势甲烷代谢途径66-68
• 4.3 牛粪和猪粪细菌群落结构分析68-69
• 4.4 牛粪和猪粪古菌群落结构分析69
• 4.5 沼气池与其发酵底物微生物群落的相关性分析69-70
• 4.6 沼气池参数与微生物群落结构比较分析70-72
• 第五章 结论72-73
• 参考文献73-83
• 在读期间研究成果83-84
• 致谢84-85
• 附录85-107

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