甲烷利用细菌的筛选及可溶性甲烷单加氧酶基因簇的克隆

【摘要】：三氯乙烯(trichloroethylene,简称TCE)在工业上应用很广，是一种优良的溶剂，常用作金属的脱脂剂，脂肪、油、香料和石蜡的萃取剂，各种天然橡胶、合成橡胶、染料、塑料、沥青的溶剂，也可用作精炼石油、酒精脱水等。但是，TCE对人体、环境有较大的危害，是控制排放的有机有毒污染物。 苯胺具致癌作用、致敏作用。苯胺可被皮肤吸收，具有刺激作用。苯胺还具有致突变性，一次给实验动物1／3≤D_(50)剂量时，可出现较明显的致突变作用。苯胺急性中毒造成顽固性贫血，血粘度降低及蛋白质代谢絮乱。血红蛋白耐力在1—3个月内不能恢复。浓度为3.0和0.3mg／m~3的苯胺可降解红细胞数和血红蛋白水平。接触胺蒸汽时，它可通过人的皮肤和胃肠道侵入，从而引起中毒。 苯酚是造纸、炼焦、炼油、塑料、农药、医药合成等行业生产的原料或中间体。随着经济的发展，未经处理的含酚废水对人类的生存环境已经造成了严重的威胁。利用微生物降解的方法处理含酚废水是一种经济有效且无二次污染的方法。 本研究利用传统微生物学的方法，从南宁市广西大学田的土样中筛选到一株甲烷利用细菌Y2(83)，能够在以甲烷为唯一碳源和能源的无机培养基上生长，通过形态观察及16SrRNA编码序列同源性比较分析，我们初步鉴定该菌株为甲基孢囊菌。通过对Y2(83)菌株在不同温度、pH值条件下的生长的情况，我们初步确定了Y2(83)的最适生长和降解苯酚的温度为32℃，最适pH值为7.0，TCE最高的耐受浓度为30mg／L。苯胺最高的耐受浓度为1500mg／L。苯酚最高的耐受浓度为800mg／L。 根据可溶性甲烷单加氧酶(sMMO)所共有的保守序列设计合成了一对引物，以Y2(83)总DNA为模板，通过PCR反应，扩增出242bp的同源片段。对该DNA序列测序，并通过序列分析表明，该片段与已报道的可溶性甲烷单加氧酶的编码基因中的mmoX有85％的同源性。以此DNA片段为探针，通过Southern blot的方法，从用部分酶切的Y2(83)总DNA中获得阳性印迹，确认其可溶性甲烷单加氧酶的编码基因的位置，进而构建了Y2(83)可溶性甲烷单加氧酶的编码基因文库。通过菌落原位杂交，找到一个含有可溶性甲烷单加氧酶的编码基因的阳性克隆，为进一步研究可溶性甲烷单加氧酶工程菌打下基础。 【关键词】：TCE[三乙烯] 苯胺 苯酚 生物降解 降解基因 sMMO 甲烷利用细菌 可溶性甲烷单加氧酶
【学位授予单位】：广西大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2004
【分类号】：Q93-331;Q785
【目录】：

• 第一章 前言6-14
• 1.1 甲烷利用细菌定义及分类6
• 1.2 MMO的类型及在细胞中的分布6
• 1.3 甲烷氧化细菌在环保上的意义6-9
• 1.4 甲烷氧化细菌所产的sMMO在生物过程上潜在应用评估9-10
• 1.5 sMMO的基因编码及基因结构10-11
• 1.6 sMMO的研究进展:11-13
• 1.7 本工作的目的13-14
• 第二章 材料与方法14-30
• 2.1 材料14
• 2.2 培养基及培养条件14-15
• 2.3 常用溶液、缓冲液15-16
• 2.4 仪器16-17
• 2.5 DNA的提取17-20
• 2.6 质粒DNA的转化20-22
• 2.7 琼脂糖凝胶电泳22
• 2.8 电洗脱法回收DNA片段22-23
• 2.9 试剂盒法快速回收DNA片段23-24
• 2.10 DNA的连接24-25
• 2.11 DNA-DNA杂交25-27
• 2.12 PCR扩增DNA片段27-28
• 2.13 ABI DNA自动测序系统测定DNA序列28
• 2.14 苯酚含量的测定28
• 2.15 TCE含量的测定28
• 2.16 苯胺的测定28-30
• 第三章 甲烷利用细菌的筛选及优化培养30-35
• 3.1 土壤样品的采集30-31
• 3.2 菌株的分离和初筛31
• 3.3 甲烷氧化细菌菌株的复筛31-32
• 3.4 YZ[83]生长条件的优化32-34
• 3.5 讨论:34-35
• 第四章 Y2(83)菌株的鉴定35-45
• 4.1 Y2(83)菌种初步鉴定35-36
• 4.3 Y2(83)菌株的165 r DNA序列分析36-38
• 4.4 PCR产物的连接与转化38
• 4.5 16srDNA PCR扩增产物的测序38-39
• 4.6 Y2(83)菌株的16SrDNA序列同源性比较39-43
• 4.7 讨论43-45
• 第五章 sMMO gene cluster中mmoX基因的部分克隆和序列分析45-51
• 5.1 引物设计45-47
• 5.2 PCR扩增及产物回收47
• 5.3 PCR产物的连接与转化47-48
• 5.4 sMMO gene cluster中mmoX基因同源片段的序列测定48
• 5.5 Y2(83)mmoX基因片段同源性分析48-50
• 5.6 讨论50-51
• 第六章 Y2(83)菌株DNA文库的构建51-58
• 6.1 Southern blotting探针的制备51
• 6.2 Y2(83)总DNA EcoRI酶切的Southern杂交51
• 6.3 Y2(83)Z总DNA的部分酶切51-54
• 6.4 sMMO gene cluster基因文库的构建54-55
• 6.5 基因文库的菌落原位杂交55
• 6.6 菌落原位杂交阳性印迹的验证55-56
• 6.7 讨论56-58
• 第七章 总结58-59
• 致谢59-65

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