首页 > 专家说

哪位能介绍一下PCR反应体系啊?请大家介绍一些生物方面的论坛

来源:江南娱乐-意甲尤文图斯亚
时间:2024-08-17 09:40:57
热度:

哪位能介绍一下PCR反应体系啊?请大家介绍一些生物方面的论坛【专家解说】:这方面的知识可以到生物帮上那里了解啊,那拥有覆盖所有实验领域的精品技术文件,图文并茂的提供生物领域的学科知

【专家解说】:这方面的知识可以到生物帮上那里了解啊,那拥有覆盖所有实验领域的精品技术文件,图文并茂的提供生物领域的学科知识、实验技术方法与技巧等,那里会有介绍。标准的PCR反应体系:10×扩增缓冲液10ul4种dNTP混合物各200umol/L引物各10~100pmol模板DNA0.1~2ugTaqDNA聚合酶2.5uMg2+1.5mmol/L加双或三蒸水至100ulPCR反应五要素:参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和缓冲液(其中需要Mg2+)PCR反应条件为温度、时间和循环次数。      温度与时间的设置:基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法,双链DNA在90~95℃变性,再迅速冷却至40 ~60℃,引物退火并结合到靶序列上,然后快速升温至70~75℃,在Taq DNA 聚合酶的作用下,使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因(长度为100~300bp时)可采用二温度点法, 除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一,一般采用94℃变性,65℃左右退火与延伸(此温度Taq DNA酶仍有较高的催化活性)。①变性温度与时间:变性温度低,解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况下,93℃~94℃min足以使模板DNA变性,若低于93℃则需延长时间,但温度不能过高,因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性,就会导致PCR失败。可 参考:IT can help you.Click www.bio1000.com/zt/experiment/rtpcr.html Sign in account.②退火(复性)温度与时间:退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至40℃~60℃,可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多,引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间,取决于引物的长度、碱基组成及其浓度,还有靶基序列的长度。对于20个核苷酸,G+C含量约50%的引物,55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度:Tm值(解链温度)=4(G+C)+2(A+T)复性温度=Tm值-(5~10℃)在Tm值允许范围内, 选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合, 提高PCR反应的特异性。复性时间一般为30~60sec,足以使引物与模板之间完全结合。③延伸温度与时间:Taq DNA聚合酶的生物学活性:70~80℃ 150核苷酸/S/酶分子70℃ 60核苷酸/S/酶分子55℃ 24核苷酸/S/酶分子高于90℃时, DNA合成几乎不能进行。PCR反应的延伸温度一般选择在70~75℃之间,常用温度为72℃,过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间,可根据待扩增片段的长度而定,一般1Kb以内的DNA片段,延伸时间1min是足够 的。3~4kb的靶序列需3~4min;扩增10Kb需延伸至15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增,延伸时间要稍长些。         酶及其浓度目前有两种Taq DNA聚合酶供应, 一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶,另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U(指总反应体积为100ul时),浓度过高可引起非特异性扩增,浓度过低则合成产物量减少。dNTP的质量与浓度 dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系,dNTP粉呈颗粒状,如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性,使用时应配成高浓度后,以1M NaOH或1M Tris。HCL的缓冲液将其PH调节到7.0~7.5,小量分装, -20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中,dNTP应为50~200umol/L,尤其是注意4种dNTP的浓度要相等( 等摩尔配制),如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低),就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度降低。模板(靶基因)核酸 模板核酸的量与纯化程度,是PCR成败与否的关键环节之一,传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。SDS的主要功能是:溶解细胞膜上的脂类与蛋白质,因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜,并解离细胞中的核蛋白,SDS 还能与蛋白质结合而沉淀; 蛋白酶K能水解消化蛋白质,特别是与DNA结合的组蛋白,再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份,用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。一般临床检测标本,可采用快速简便的方法溶解细胞,裂解病原体,消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离,直接用于PCR扩增。RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法,要防止RNase降解RNA。Mg2+浓度 Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响,在一般的PCR反应中,各种dNTP浓度为200umol/L时,Mg2+浓度为1.5~2.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高,反应特异性降低,出现非特异扩增,浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性,使反应产物减少。
  1. 哪位能提供山东寿光七里庄王氏家谱,不胜感激。其中有“中庆相传”,上下如何延续
    2024-08-17
  2. 太阳能电池片生产工艺,哪位大神可以帮忙?
    2024-08-17
  3. 有哪位可以告知下,距离宁海南溪温泉和前童古镇2个景点之间价位150-200的酒店或者宾馆。
    2024-08-17
  4. 2011年月19日,全国低碳经济媒体联盟,在北京首次发布的《中国低碳城市评价体系》,有谁知道内容??
    2024-08-17
  5. 从哪几个方面实现构建低碳化发展新体系,谢谢。
    2024-08-17
  6. 请问一下,哪位知道兴业太阳能集团是什么和什么的合资公司啊?
    2024-08-17
  7. 我单位是生产二次供水设备的,可以做哪些体系和认证?
    2024-08-17
  8. 有哪位知道古镇 在哪里冲煤气,怎么走???
    2024-08-17
  9. 哪位知道山西阳泉到山东寿光煤炭的火车运费大概一吨多少钱,有坐过的朋友最好给个准确数,谢谢大家
    2024-08-17
  10. 阳城煤矿香煤的指标谁知道。热量,灰分,水分,挥发份,硫,,固定碳都是多少,哪位仁兄能告诉我
    2024-08-17
  11. 想自己开车去安昌古镇,哪位大虾指点下怎么走?
    2024-08-17
  12. 我要成立出租车公司政府要我写一份可行性报告请哪位朋友帮忙指导
    2024-08-17
  13. 从电厂经过电网输送给用电者的输电过程哪位能给我简单讲一下啊?
    2024-08-17
  14. 本届2014年世界杯时间哪位能帮我说下
    2024-08-17
  15. 哪位能告知我BTV各个频道的属性?
    2024-08-17
Baidu
map