蛋黄中提取胆固醇的方法

【专家解说】：胆固醇的 1 主题内容与适用范围 本标准规定了用分光光度计测定各类动物性食品中胆固醇的方法。 本标准适用于各类动物性食品中胆固醇的测定。 2 原理 当固醇类化合物与酸作用时，可脱水并发生聚合反应，产生颜色物质。 因此可先 对食品样品进行提取和皂化，用硫酸铁铵试剂作为显色剂，测定食品胆固醇的含量。 3 试剂 全部试剂除注明外均为分析纯，试验用水为蒸馏水。 3.1 石油醚。 3.2 无水乙醇。 3.3 浓硫酸。 3.4 冰乙酸：优级纯。 3.5 磷酸。 3.6 胆固醇标准物质。 3.7 胆固醇标准液。 3.7.1 胆固醇标准储备液（1mg/mL）：精确称取胆固醇100mg，溶于冰乙酸中，并定 容至100mL。此液至少在2个月内保持稳定。 3.7.2 胆固醇标准常备液（100(g/mL）：吸取胆固醇标准储备液10mL，用冰乙酸定 容至100mL。此液用时临时配制。 3.8 铁钒显色剂。 3.8.1铁钒储备液：溶液4.463g硫酸铁铵〔FeNH4(SO4)2•H2O〕于100mL85％磷酸中， 贮于干燥器内，此液在室温中稳定。 3.8.2 铁钒显色液：吸取铁钒储备液10mL，用浓硫酸定容至100mL。贮于干燥器内， 以防吸水。 3.9 50％氢氧化钾溶液：称取50g氢氧化钾，用蒸馏水溶解，并稀释至100mL。 3.10 5％氯化钠溶液：称取5g氯化钠，用蒸馏水溶解，并稀释至100mL。 3.11 钢瓶氮气：纯度99.99％。 4 仪器和设备 4.1 实验室常用设备。 4.2 721型分光光度计。 4.3 电热恒温水浴。 4.4 电动振荡器。 4.5 具玻塞试管：体积100ml、25mL。 5 操作步骤 5.1 胆固醇标准线 吸取胆固醇标准常备液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0mL分别置于10mL试管内，在各 管内加入冰乙酸使总体积皆达4mL。沿管壁加入2mL铁钒显色液，混匀，在15～90min 内，在560～575nm波长下比色。以胆固醇标准浓度为横坐标， 吸光度之为纵坐标做 标准曲线。 5.2 样品测定 5.2.1 食品脂肪的提取与测定 根据食品种类分别用索氏脂肪提取法、研磨浸提法和罗高氏法提取脂肪。 并计 算出每100g食品中的脂肪含量。 5.2.2 食品胆固醇的测定 将提取的油脂3～4滴（约含胆固醇300～500mg ），置于25mL试管内，准确记录其重量。加入4mL无水乙醇，0.5mL50%氢氧化钾溶液，在65℃恒温水浴中皂化1h。皂化时每隔20～30min振荡一次使皂化完全。皂化完毕，取出试管，冷却。加入3mL5％氯化钠溶液，10mL石油醚，盖紧玻塞，在电动振荡器上振摇2min， 静置分层（一般 约需1h以上）。 取上层石油醚液2mL，置于10mL具玻塞试管内，在65℃水浴中用氮气吹干，加入 4mL冰乙酸，2mL铁钒显色液，混匀，放置15min后在560～575nm波长下比色，测得吸光度，在标准曲线上查出相应的胆固醇含量。 6 结果计算 m×V×c 1 X＝———————— ×———— V1×m1 1000 式中： X—样品中胆固醇含量，mg/100g； m—测得的吸光度值在胆固醇标准线上显示的胆固醇含量，mg ； V—石油醚总体积，mL； v1—取出的石油醚体积，mL； m1—称取食品油脂样品量，g； c—食品样品油脂含量，g/100g； 1/1000—折算成每100g食品中胆固醇毫克数。 7 平均允许误差 同一实验室同时或连续两次测定结果之差不得超过平均值的10％。 8 标准曲线 0.60├ │ 0.50├ │ 0.40├ │ 0.30├ │ 0. 20├ │ 0.10├ │ 0. 00└————┴————┴————┴————┘ 0 50 100 150 200mg 胆固醇标准曲线 ———————————┬——————┬——————┬—————— 测定时间 │ │ │ 胆固醇，mg │ 1985 │ 1990 │ 1991 ———————————┼——————┼——————┼—————— 50 │ 0.132 │ 0.130 │ 0.130 100 │ 0.255 │ 0.260 │ 0.255 150 │ 0.390 │ 0.390 │ 0.390 200 │ 0.515 │ 0.510 │ 0.513 ———————————┴——————┴——————┴—————— 注：表中每个值均为三个测定值的平均值。