利用甲烷氧化混合菌生物合成聚β-羟基丁酸酯

【摘要】：聚p-羟基丁酸酯(PHB)是大多数细菌细胞内碳源和能源的储备物,具有生物可降解性,热塑性,且透氧率低,用作食品包装用膜、袋,饮料用包装内衬层和生鲜食品盘等,更利于食品的储藏运输,在食品包装领域具有广阔的应用前景,日益受到人们的关注。目前,PHB的商业化生产主要基于野生菌和基因工程菌的纯菌种发酵工艺,严格控制的无菌底物和生产环境导致了较高的生产成本,从而限制了生物塑料PHB的大规模应用,特别是在食品包装中的应用。富集高产PHB、组成稳定的混合菌在开放条件下,以甲烷甲醇等一碳化合物生产PHB成为目前实现PHB在食品包装领域中规模化应用最具前景的研究课题。 本学位论文利用从黑龙江省大庆油田富含沼气地区的土壤中培养筛选获得的甲烷氧化混合菌,以甲烷为碳源通过好氧瞬时供料方式(充盈-饥饿交替),筛选掉其中PHB含量少的菌株,对菌群中开放条件下稳定高产PHB的甲烷氧化菌进行了富集。通过甲烷氧化混合菌的结构解析,对菌群中分离纯化的非甲烷氧化菌和甲烷氧化菌的生长和催化性能的初步探索,以及优化细胞培养环境,高密度甲烷氧化混合菌发酵培养方式的探索,建立了开放条件下以廉价碳源稳定合成PHB的方法。 (1)根据甲烷氧化混合菌细胞生长规律,建立基于Logistic模型的细胞生长动力学模型： 经对比验证结果表明,对于不同的培养条件,该动力学模型对细胞生长密度(用吸光度OD600表示)的计算值与实验值之间都具有较好的相关性,相关系数均达到92%以上。这表明应用" Logistic模型”建立的动力学模型对甲烷氧化混合菌具有较好的适用性,可以进行实际工作中的模拟研究,该模型中各参数和特征值随培养条件而变化,适用于发酵条件优化控制,为后续细胞高密度培养提供指导。 (2)采用充盈-饥饿(feast-famine cycle)模式间歇供料,以甲烷为底物好氧开放式培养甲烷氧化混合菌,利用苏丹黑染色法动态检测充盈和饥饿阶段胞内PHB含量变化,实现了菌群中高PHB存储能力的甲烷氧化菌的富集和稳定传代。结果显示,在充分供氧条件下,充盈培养5d,饥饿培养15d,循环培养5次,PHB含量从10.8%增加到36.6%,且富集后甲烷氧化混合菌经过开放条件下连续传代培养,细胞生长和PHB合成稳定,表明甲烷氧化混合菌具有菌群组成稳定性,适于PHB工业化生产。 (3)通过对富集后的甲烷氧化混合菌进行菌群结构及生长生长特性分析,推测了混合菌体系中不同微生物间的协同作用机理：甲基弯菌JW和JC能以甲烷、甲醇作为碳源生长,并为伴生菌提供从甲烷、甲醇得到的代谢碳供伴生菌生长,伴生菌的存在可以及时利用代谢中间产物有效避免产物抑制,同时为甲基弯菌JW和JC提供生长因子,促进细胞生长。甲烷氧化混合菌分离出来的重要成员甲基弯菌JC能高效利用甲醇生长,能增强甲烷氧化混合菌对甲醇的耐受性,促使混合菌体系无需驯化直接利用甲醇为碳源生长,避免由于甲烷在培养基中溶解度低而导致细胞生长慢的问题,为高密度培养打下基础。基于物种间的自然选择和竞争,以碳饥饿作为选择压力,通过甲烷为碳源短期充盈(5d)长期饥饿(15d)循环交替的富集方式,形成了能长期耐受碳饥饿的高PHB存储能力的甲烷氧化菌-伴生菌共生的微生态系统,其在开放条件下也不易受到杂菌的污染,更具环境适应性而长期稳定生长并积累PHB。 (4)在掌握了细胞的基本生长规律和胞内PHB积累能力的基础上,利用富集后的甲烷氧化混合菌以廉价碳源甲烷、甲醇生长的优势,通过调整碳源供给、培养基组成等手段优化胞外生长环境促进胞内PHB积累,以少量甲醇的加入在原有基础上大幅提高了细胞产量及胞内PHB的积累能力。对营养平衡-营养受限两阶段培养的最佳培养基组分和培养时间的实验结果表明,在相同的碳源补加方式下,优化后的营养平衡(培养6d)-营养受限(培养6d)的两段式培养方式不仅可以明显提高PHB的含量,最高可达61.5%,而且并没有完全抑制细胞生长,细胞干重达到1.35g/L,实现了细胞生长密度和单位细胞PHB积累量的提高,在一定程度上解决了细胞生长与PHB积累的矛盾。 (5)甲烷氧化混合菌可在开放条件下利用甲醇代替甲烷做为唯一碳源生长并在细胞内合成PHB,且甲醇能够较大程度的促进菌体生长和PHB的胞内积累。通过对富集后甲烷氧化混合菌在发酵罐培养过程中细胞生长动力学的研究,以延滞期和最大比增长速度为依据,对发酵罐的碳源补加量和补加方式进行优化,建立提高PHB产量为目的甲醇流加策略,通过分批补加不同浓度碳源(甲醇),解除高浓度甲醇的抑制作用,为菌体生长和PHB的胞内合成提供适宜的碳源利用环境,从而明显缩短发酵时间,提高甲烷氧化混合菌胞内PHB的积累量。根据发酵罐培养细胞的生长规律,建立了开放条件下一段式的发酵罐发酵生产PHB的方法,简化了操作步骤,提高了生产效率。经过10d的分批发酵培养,细胞干重可达3.1g/L, PHB含量提升至78.4%。 【关键词】：聚β-羟基丁酸酯(PHB) 甲烷氧化混合菌 开放式 充盈-饥饿模式 富集
【学位授予单位】：哈尔滨商业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：TQ929;TS206.4
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-18
• 1 绪论18-36
• 1.1 引言18-19
• 1.2 PHB概述19-24
• 1.2.1 聚羟基链烷酸(PHAs)的结构和分类19-20
• 1.2.2 PHB的国内外研究现状20-21
• 1.2.3 PHB的结构、特性及应用21-22
• 1.2.4 PHB生物合成途径22-24
• 1.2.5 PHB的生物降解24
• 1.3 合成PHB的研究现状24-34
• 1.3.1 利用微生物生产PHB24-33
• 1.3.2 利用转基因植物生产PHB33
• 1.3.3 化学法合成PHB33-34
• 1.4 本论文的研究思路34-36
• 1.4.1 研究背景意义及存在问题34
• 1.4.2 立题依据和可行性分析34
• 1.4.3 主要研究内容34-36
• 2 甲烷氧化混合菌的生长特性与PHB的积累36-52
• 2.1 引言36
• 2.2 实验材料与仪器36-37
• 2.2.1 实验材料36-37
• 2.2.2 主要实验仪器37
• 2.3 实验方法37-39
• 2.3.1 培养基组成及菌种来源37-38
• 2.3.2 以甲烷为唯一碳源进行摇瓶开放式培养38
• 2.3.3 以甲醇为碳源进行摇瓶开放式培养38
• 2.3.4 甲烷气氛下添加甲醇进行摇瓶开放式培养38
• 2.3.5 其他碳源供给下进行摇瓶开放式培养38-39
• 2.3.6 不同Cu~(2+)浓度下进行摇瓶开放式培养39
• 2.4 分析与检测39-41
• 2.4.1 细胞生长量的测定39
• 2.4.2 PHB的分析提取检测39-40
• 2.4.3 总MMO酶活的测定40-41
• 2.5 结果与讨论41-51
• 2.5.1 甲烷氧化混合菌中PHB的检测分析41-42
• 2.5.2 甲烷氧化混合菌胞内PHB检测方法的改进42-43
• 2.5.3 甲烷氧化混合菌生长动力学模型的建立及验证43-45
• 2.5.4 甲醇培养对细胞生长的影响45-47
• 2.5.5 甲烷氧化混合菌的底物专一性47-49
• 2.5.6 Cu~(2+)浓度对甲烷氧化混合菌的影响49-51
• 2.6 本章小结51-52
• 3 高PHB存储能力甲烷氧化混合菌的富集52-62
• 3.1 引言52
• 3.2 实验材料与仪器52-53
• 3.2.1 实验材料52-53
• 3.2.2 主要实验仪器53
• 3.3 实验方法53
• 3.3.1 培养基配方及菌种来源53
• 3.3.2 开放条件下以甲烷为唯一碳源进行充盈阶段摇瓶培养53
• 3.3.3 开放条件下进行饥饿阶段摇瓶培养53
• 3.4 分析与检测53-54
• 3.4.1 细胞生长量的测定53-54
• 3.4.2 细胞积累PHB的形态观察54
• 3.4.3 PHB的分析提取检测54
• 3.4.4 总MMO酶活的测定54
• 3.5 结果与讨论54-60
• 3.5.1 苏丹黑染色快速检测法54-55
• 3.5.2 充盈-饥饿富集方式的确立55-58
• 3.5.3 富集后甲烷氧化混合菌的特性58-60
• 3.6 本章小结60-62
• 4 甲烷氧化混合菌的分离纯化及其相互作用机理62-76
• 4.1 引言62
• 4.2 实验材料与仪器62-63
• 4.2.1 实验材料62-63
• 4.2.2 主要实验仪器63
• 4.3 实验方法63-65
• 4.3.1 菌种来源与培养基组成63
• 4.3.2 以甲烷为唯一碳源进行培养63-64
• 4.3.3 显微镜观察64
• 4.3.4 菌种分离纯化64
• 4.3.5 MMO活性检测方法64
• 4.3.6 甲醇检测64
• 4.3.7 16S rDNA序列分析64
• 4.3.8 PHB的检测分析64-65
• 4.4 结果与讨论65-74
• 4.4.1 甲烷氧化混合菌的微生物菌群分析65-71
• 4.4.2 甲烷氧化混合菌中微生物的协同作用机理71-74
• 4.5 本章小结74-76
• 5 提高甲烷氧化混合菌的PHB产量条件的优化76-90
• 5.1 前言76-77
• 5.2 实验材料与仪器77-78
• 5.2.1 实验材料77
• 5.2.2 主要实验仪器77-78
• 5.3 实验方法78-79
• 5.3.1 菌种来源与培养基组成78
• 5.3.2 培养基不同组分初始浓度的影响作用78
• 5.3.3 不同生长期对PHB积累的影响78
• 5.3.4 PHB的检测分析78-79
• 5.4 结果与讨论79-89
• 5.4.1 培养基中不同营养元素的影响作用79-83
• 5.4.2 优化的培养基中细胞生长和PHB积累83-84
• 5.4.3 不同生长时期对细胞积累PHB的影响84-89
• 5.5 本章小结89-90
• 6 甲烷氧化混合菌的高效发酵工艺90-104
• 6.1 引言90-91
• 6.2 实验材料与仪器91
• 6.2.1 实验材料91
• 6.2.2 主要实验仪器91
• 6.3 实验方法91-94
• 6.3.1 菌种来源及培养基组成91-92
• 6.3.2 不同碳源条件下发酵罐发酵培养92
• 6.3.3 模拟连续发酵方式培养细胞92-93
• 6.3.4 发酵过程的细胞生长动力学考察93
• 6.3.5 分批发酵培养中甲醇的流加方式93-94
• 6.4 结果与讨论94-102
• 6.4.1 不同碳源条件下的细胞生长和PHB积累94-95
• 6.4.2 模拟连续发酵培养方式的细胞生长与PHB积累研究95-97
• 6.4.3 甲醇为唯一碳源条件下的分批发酵培养97-99
• 6.4.4 甲醇流加方式的建立99-101
• 6.4.5 一段式高效生产PHB的补料分批发酵培养体系的建立101-102
• 6.5 本章小结102-104
• 结论104-105
• 创新点105-106
• 参考文献106-122
• 附录122-124
• 攻读学位期间发表的学术论文124-126
• 致谢126

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