基因改造和驯化细菌利用水葫芦发酵联产氢气和甲烷的机理研究

【摘要】：随着化石能源的日益短缺和环保要求的逐渐提高,氢能作为清洁、高效的可再生能源载体越来越受到人们的重视。利用生物质原料通过细菌发酵方法制取氢气新能源具有很强的应用前景,而通过基因工程和代谢调控手段改造产氢细菌是生物制氢领域的研究热点。本文在国际上首次测得阴沟肠杆菌在过表达产氢增强基因后的氢酶活性提高了97.4%,利用混合菌群驯化和微波稀酸水解联合活性炭脱毒使水葫芦发酵产氢量提高了111.1%；500升半连续中试得到水葫芦发酵联产氢气和甲烷的能源转化效率达到51.3%。 本文首先以高效产氢细菌阴沟肠杆菌Enterobacter cloacae CICC10017和产气肠杆菌Enterobacter aerogenes ATCC13408为主要研究对象,对其过表达外源产氢增强基因后的氢酶活性、利用葡萄糖的产氢能力和代谢途径进行了研究。阴沟肠杆菌E. cloacae CICC10017在过表达了一种产氢增强基因后,氢酶活性由原来的270.93ml-H2/(g-DW·h)提高到了534.78ml-H2/(g-DW-h),单位底物产氢量也由1.29mol-H2/mol-葡萄糖提高到了2.54mol-H2/mol-葡萄糖,产氢量提高了97.9%。改造菌的发酵液中乙酸和丁酸的产量增加,乙醇产量减少,这与产氢量高时的NADH代谢机理是一致的。产气肠杆菌Enterobacter aerogenes ATCC13408在过表达氢酶hyc操纵子大、小亚基的基因后,氢酶活性分别提高了124%和67%,氢气产量也由1.16mol-H2/mol-葡萄糖分别提高至2.16mol-H2/mol-葡萄糖和1.97mol-H2/mol-葡萄糖；在过表达了蓝藻Synechocystis sp. PCC6803氢酶hoxUYH基因后,氢酶活性提高了153.8%,氢气产量由1.27mol-H2/mol-葡萄糖提高到2.39mol-H2/mol-葡萄糖。在此基础上又进行了基因改造细菌利用预处理水葫芦产氢的实验研究,过表达产氢增强基因后的阴沟肠杆菌利用水葫芦产氢能力最高,产量为74.9ml-H2/g-TVS。 本文针对木质纤维素、蛋白质和油脂等三大类复杂有机物的发酵联产氢气和甲烷特性开展了研究。利用生物质原料对混合菌群进行驯化培养加强优势菌种的适应性,对大分子有机物强化水解得到易于发酵的小分子原料。16S rDNA分析结果表明,混合菌种经过木糖驯化培养富集,种群多样性更高,多种梭菌属并存为优势菌种,种群多样性提高使木糖的产氢量提高了45%。木糖联产氢气和甲烷量为190.6ml-H2/g-木糖和216.5ml-CH4/g-木糖,联产的能源转化率达67.48%。乳蛋白联产氢气和甲烷量为136.5ml-H2/g-TVS和157.8ml-CH4/g-TVS,联产的能源转化效率为41.9%。 水葫芦经过稀酸/微波/酶预处理工艺,其水解糖化率可以达到91.36%,从而使水葫芦发酵产氢量比常规的酶水解显著提高了62.8%,而采用混合菌群驯化后使水葫芦发酵产氢量提高了95.5%,进一步使用活性炭脱毒后使水葫芦发酵产氢量提高了111.1%。水葫芦暗发酵得到氢气产量为134.9ml-H2/g-TVS,利用其产氢废液继续联产甲烷量为107.7ml-CH4/g-TVS。利用50升和500升的两个串联发酵罐实现了水葫芦发酵联产H2和CH4的半连续流中试,得到连续稳定的氢气和甲烷产生速率分别为340.9±36.6ml-H2(L·d)和184.3±10.4ml-CH4/(L·d)。利用混合菌群驯化和微波稀酸水解使水葫芦中试联产氢气和甲烷的能源转化效率提高到51.3%。 【关键词】：氢气 甲烷 发酵 细菌 基因改造 驯化 生物质 水葫芦
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：TK91
【目录】：

• 致谢5-7
• 前言7-8
• 摘要8-10
• Abstract10-13
• 目录13-18
• 1 绪论18-36
• 1.1 氢能的研究意义18-22
• 1.2 微生物制氢的国内外研究现状22-32
• 1.2.1 产氢微生物的种类22-23
• 1.2.2 微生物的产氢机制23-28
• 1.2.3 氢酶的特点分类28-30
• 1.2.4 生物制氢的关键技术30-31
• 1.2.5 生物制氢的限制瓶颈31-32
• 1.3 本文研究目的和内容32-36
• 1.3.1 研究目的32-33
• 1.3.2 研究内容33-36
• 2 实验材料和方法36-64
• 2.1 产氢菌种基因改造实验36-47
• 2.1.1 材料和试剂36-39
• 2.1.2 基因改造方法39-41
• 2.1.3 实验设备41-47
• 2.2 细菌氢酶活性测定47-48
• 2.2.1 材料和试剂47
• 2.2.2 实验装置47-48
• 2.2.3 氢酶活性测定方法48
• 2.3 混合产氢菌和产甲烷菌的培养富集48-50
• 2.3.1 培养基的配制49
• 2.3.2 混合菌群富集方法49-50
• 2.4 发酵产氢及联产甲烷系统50-56
• 2.4.1 实验室小试发酵系统51
• 2.4.2 中试发酵系统51-53
• 2.4.3 附属设备53-56
• 2.5 发酵原料与产物的分析测定56-64
• 2.5.1 发酵原料的TVS测定方法56-57
• 2.5.2 还原糖的测定方法57-58
• 2.5.3 有机物化学成分的测定方法58
• 2.5.4 生物气成分与浓度测定方法58-59
• 2.5.5 发酵液相副产物的测定方法59-64
• 3 基因改造细菌的氢酶活性分析64-72
• 3.1 引言64-65
• 3.2 阴沟肠杆菌基因改造前后的氢酶活性65-67
• 3.2.1 促进产氢蛋白HPP基因的过表达65-66
• 3.2.2 E.cloacae CICC10017/HPP的氢酶活性66-67
• 3.3 产气肠杆菌基因改造前后的氢酶活性67-70
• 3.3.1 E.aerogenes氢酶操纵子大小亚基基因hycE和hycG的表达67-68
• 3.3.2 E.aerogenes/HycE和E.aerogenes/HycG的氢酶活性68-69
• 3.3.3 蓝藻Synechocystis sp.PCC 6803氢酶hoxUYH基因的表达69
• 3.3.4 E.aerogenes/HoxUYH的氢酶活性69-70
• 3.4 本章小结70-72
• 4 基因改造细菌的发酵产氢能力和代谢分析72-84
• 4.1 引言72
• 4.2 阴沟肠杆菌基因改造后的产氢特性和代谢分析72-78
• 4.2.1 E.cloacae CICC10017/HPP的产氢特性72-74
• 4.2.2 氮源对发酵产氢的影响74
• 4.2.3 发酵液相副产物及代谢途径分析74-78
• 4.3 产气肠杆菌过表达氢酶大小亚基基因后的产氢特性及代谢分析78-80
• 4.3.1 E.aerogenes/HycE和E.aerogenes/HycG的产氢特性78-80
• 4.3.2 发酵液相副产物及代谢途径分析80
• 4.4 产气肠杆菌过表达蓝藻氢酶后的产氢特性及代谢分析80-82
• 4.4.1 E.aerogenes/HoxUYH的产氢特性80-81
• 4.4.2 发酵液相副产物及代谢途径分析81-82
• 4.5 本章小结82-84
• 5 基因改造细菌利用水葫芦的发酵产氢特性84-90
• 5.1 实验方案85
• 5.2 阴沟肠杆菌基因改造后利用预处理水葫芦的产氢结果85-86
• 5.3 产气肠杆菌过表达氢酶大小亚基基因后利用预处理水葫芦的产氢结果86-88
• 5.4 产气肠杆菌过表达蓝藻氢酶后利用预处理水葫芦的产氢结果88-89
• 5.5 本章小结89-90
• 6 三大类有机物发酵联产氢气和甲烷的研究90-114
• 6.1 引言90-91
• 6.2 木糖发酵联产氢气和甲烷91-101
• 6.2.1 实验方案92-93
• 6.2.2 产氢菌的培养与驯化93
• 6.2.3 产氢菌群落的16S rDNA基因分析93-96
• 6.2.4 木糖发酵产氢结果96-98
• 6.2.5 联产甲烷结果及液相成分分析98-99
• 6.2.6 联产能源转化效率99-101
• 6.3 蛋白质发酵联产氢气和甲烷101-106
• 6.3.1 实验方案101-102
• 6.3.2 脱脂奶粉和乳糖发酵产氢结果102-104
• 6.3.3 产氢废液联产甲烷结果104-105
• 6.3.4 乳蛋白发酵联产氢气和甲烷的分析105-106
• 6.3.5 联产能源转化效率106
• 6.4 油脂发酵联产氢气和甲烷106-112
• 6.4.1 实验方案106-108
• 6.4.2 产氢菌的培养与驯化108
• 6.4.3 油脂发酵产氢的影响因素108-110
• 6.4.4 联产甲烷结果及液相成分分析110-112
• 6.4.5 联产能源转化效率112
• 6.5 本章小结112-114
• 7 水葫芦经稀酸/微波/酶预处理发酵联产氢气和甲烷的研究114-122
• 7.1 引言114
• 7.2 实验方法114-116
• 7.2.1 水葫芦的预处理114-115
• 7.2.2 产氢菌的驯化培养115
• 7.2.3 实验方案115-116
• 7.2.4 测试方法116
• 7.3 水葫芦的水解糖化率116
• 7.4 活性炭脱毒对水葫芦发酵产氢的影响116-118
• 7.5 产氢废液发酵联产甲烷结果118-120
• 7.6 联产能源转化效率120
• 7.7 理论计算及讨论120-121
• 7.8 本章小结121-122
• 8 水葫芦发酵联产氢气和甲烷的500L中试研究122-128
• 8.1 引言122
• 8.2 500L中试实验装置122-123
• 8.3 水葫芦的预处理方法123-124
• 8.4 500L中试联产工艺流程124-125
• 8.5 中试实验结果和讨论125-127
• 8.5.1 水葫芦水解糖化率及利用率125
• 8.5.2 水葫芦中试半连续联产氢气甲烷结果125-126
• 8.5.3 中试联产实验的能源转化效率126-127
• 8.6 本章小结127-128
• 9 全文总结128-132
• 9.1 全文总结128-130
• 9.2 主要创新点130
• 9.3 工作不足与展望130-132
• 参考文献132-150
• 攻读博士学位期间参加科研项目和发表学术论文150-151

您可以在本站搜索以下学术论文文献来了解更多相关内容

低阶煤和生物质煤浆表面改性及其成浆特性研究    李响

氢能及其应用前景分析    蔡炽柳;

氢能源研究现状    穆亚玲;王香爱;

氢能的重要性和制氢方法浅析    潘健民;魏运洋;李永峰;徐菁利;

水葫芦厌氧发酵产气规律    兰吉武,陈彬,曹伟华,赵由才

国内外水葫芦防治研究综述    江洪涛,张红梅

红假单胞菌利用畜禽粪便产氢能力的试验研究    尤希凤,周静懿,张全国,王艳锦

氢能制取和储存技术研究发展综述    欧训民;

论氢能源和氢能源系统    肖建民

能源科学发展战略研究    吴承康,徐建中,金红光

简评储氢与制氢研究中的问题与进展    周理;

重组产气肠杆菌提高产氢效率的研究    赵锦芳

不同营养水平对鲁禽3号麻鸡配套系肌肉品质的影响    雷秋霞;曹顶国;韩海霞;李福伟;逯岩;

预处理秸秆与氮肥配施对两种土壤微生物量碳、氮动态变化的影响    张娟;沈其荣;蔡相鲁;李铁男;叶文婷;

不同基因型甘薯品种产量及营养成分的动态变化    张晓艳;王丽丽;刘淑云;封文杰;王风云;朱建华;

罗曼蛋鸡饲粮养分转化率的研究    丁昌春,张宇,周明

过瘤胃脂肪对绵羊瘤胃内环境的影响    滕佳伍;穆叔琴;高玉鹏;王文杰;李千军;马志芳;张晓青;

氨基酸平衡对异育银鲫鱼生长及表观消化率的影响    王爱民;邵荣;刘汉文;李朝霞;殷玉岗;赵永刚;

喹胺醇饲料添加剂对肉鸡生长的影响    曹香林;陈建军;张力;梁剑平;

新鲜饲料作物及作物秸秆高密度成型产品的试验研究    杜健民;李旭英;苏成云;郑雪飞;

外源酶对草鱼鱼种生长及饲料表观消化率的影响    黄峰;施培松;文华;魏开建;严安生;

饲用玉米·高丹草·饲用高粱降解规律的研究    闫华锋;董宽虎;姜玉锁;

氢能源应用的消防安全初探    司戈;

棕榈油脂肪酸钙制备工艺优化研究    王洪荣;郝青;周永康;李国祥;

裹包全混合日粮对奶牛生产性能和消化特性的影响    张俊瑜;王晶;卜登攀;国卫杰;宋增廷;王加启;

双乙酸钠对裹包TMR贮存效果的影响    国卫杰;王加启;王晶;卜登攀;张俊瑜;宋增廷;周凌云;

不同添加剂对全株玉米青贮品质影响的研究    李志强;张翔;崔志文;许庆方;

大菱鲆幼鱼蛋白质生态营养需要量与菱形特征    李勇;蒋克勇;王雷;王优军;

几种能源草中化学成分利用指数分析    李峰;王宗礼;孙启忠;

外来入侵植物水葫芦及其防治技术    殷利利;谭万忠;

青贮玉米不同混播方式对牧草产量和品质的影响    李洪影;高飞;刘昭明;崔国文;

达乌里胡枝子的青贮    许庆方;韩建国;玉柱;孙启忠;刘建宁;

添加剂对钯纳米晶的形成及电催化性能的影响    白正宇

活性炭及其改性催化剂应用于碘化氢分解的性能及机理研究    陈云

淀粉/纤维素类生物质发酵联产氢气和甲烷的机理研究    谢斌飞

麦秆液化制备可降解聚氨酯泡沫材料方法及机理研究    陈秋玲

毛竹颗粒表面化学/水热修饰及其增强PVC基复合材料性能表征    王会

可再生能源发电政策与环境效益分析方法研究    秦湘灵

秸秆和秸秆木质素在土壤中的降解及其对土壤性质的影响    刘继培

铝基材料快速水解制氢的研究    陈星宇

饲草型全混日粮饲用价值评价研究    王晓光

多元醇液相重整制氢的催化剂研究    刘俊

铁锰硅对凤眼莲生物质结构的影响    武少伟

高产胞外多糖乳酸乳杆菌的选育及其发酵条件的优化    陈若雯

高碳煤矸石与采残煤矿井下生物转化可燃气研究    唐敏

纤维床固定化酪丁酸梭菌产丁酸的研究    项宜娟

可降解育苗盘及其在半夏组培苗栽培中的应用研究    周滢

桦褐孔菌胞外多糖液体深层发酵及木质纤维素促进产糖效果的研究    陈辉

玉米秸秆预处理及对发酵产氢效果影响研究    曾召刚

杜氏盐藻异养转化藻株的鉴定及初步功能分析    吕文兵

成年藏獒犬蛋白质需要量及对常规饲料消化代谢的研究    周俊

不同水平柠条对奶牛生产性能和消化性能的影响    方姝骄

水稻不同品种叶表面硅质细胞的扫描电镜观察    杨秉耀;陈新芳;刘向东;郭海滨;

改性处理对水稻秸秆纤维结构和性能的影响    陈晓浪;胡书春;周祚万;

低阶煤高温高压水热处理改性及其成浆特性    赵卫东;刘建忠;周俊虎;曹晓哲;张光学;岑可法;

微波-NaOH预处理稻杆纤维素的实验研究    覃杏珍;张玉军;巩桂芬;

改性木质素磺酸盐水煤浆添加剂对神华煤制浆性能的影响    张群彩;杨东杰;楼宏铭;邱学青;

水煤浆稳定性的影响因素及评定方法    支献华

低挥发分煤的成浆性研究    胡维斌;何国锋;段清兵;

神华煤微波改性提高成浆性能的研究    周俊虎;李艳昌;程军;李珊珊;赵晓辉;刘建忠;岑可法;

水煤浆掺混湿污泥对浆体成浆特性的影响    王睿坤;刘建忠;胡亚轩;高夫燕;周俊虎;岑可法;

神木煤的主要性质对其水煤浆特性的影响    吴家珊,吉庆军,郝爱民,孙成功,梁红

微波对纤维素纤维结构与性能的影响及应用研究    张丽

新型高效水煤浆添加剂的研究    桂斌

精细水煤浆的颗粒孔隙、成浆及燃烧机理研究    李珊珊

水煤浆添加剂及工业废液与煤种的适配规律研究    刘彩芳

河蟹对水葫芦生长的影响    江锦坡,金春华,徐镇,陆开宏

汽油与水和氧混合重整制氢气    朱文良,韩伟,张小亮,熊国兴,杨维慎

pH、ORP制约的产酸相发酵类型及顶级群落    赵丹,任南琪,王爱杰

硼氢化钠制氢技术    孙雷,李宁,王桂香,黎德育

燃料电池及其发展概况    吴忻

煤气化制氢技术    徐振刚,吴春来

发展新能源的新趋势:开发煤层气    牛松森 ,王惠 ,陈永奇

解偶联剂CCCP对莱茵衣藻光照产氢过程的调控    冉春秋;张卫;虞星炬;金美芳;邓麦村;

发酵产氢细菌分离培养的厌氧实验操作技术    李永峰,任南琪,陈瑛,李建政,胡立杰,郑国香

氢能及制氢的应用技术现状及发展趋势    王艳辉,吴迪镛,迟建

利用畜禽粪便为原料生产优质厌氧发酵液工艺条件的研究    姚燕

市政污泥厌氧发酵产氢的试验研究    陈文花

石油的代用能源——氢的性质、制取、储存和应用    李厚生;

车用燃料电池的燃料选择及燃料转化制氢研究进展    王仙体;翁惠新;李文儒;祁顺仁;马全天;

干涉光谱法的氢气遥测系统设计    陶坤宇;孙金霞;付森;周彦平;

色谱监测氢气异常的分析与讨论    诸葛瑞巍;潘琪杰;吴政宽;

高压氢气隔膜压缩机的开发及应用    简建明;陈如意;

玉米秸秆厌氧生物发酵制氢的特性研究    孙学习;李涛;任保增;樊耀亭;

焦炉煤气制氢工艺存在的问题和应对方案    韩荟瑾;

二甲醚自热重整制氢过程的热力学分析    潘相敏;寇素原;王晓蕾;马建新;

微尺度燃烧中的温度及热回流分布    杨卫娟;周俊虎;汪洋;黄镇宇;刘建忠;岑可法;

氢气纯度对多晶硅产品质量的影响及采取的对策    廖敏;

污泥和水葫芦混合发酵产氢的影响因素分析    程军;潘华引;戚峰;周俊虎;刘建忠;岑可法;

浅论淀粉的能源转化技术    张品;王艳丽;刘钟栋;韩杰;白红超;

氢气在单壁碳纳米管中吸附的计算机模拟    顾冲;高光华;于养信;毛宗强;

氢气在单壁碳纳米管中及附的计算机模拟    顾冲;高光华;于养信;毛宗强;

高通量筛选技术在氨分解制不含CO_x氢中的应用    刘红超;王华;沈江汉;孙颖;刘中民;

介孔纳米二氧化钛光解水性能研究    易华兵;彭天右;宋海波;赵德;昝菱;

氢气在汽车燃油替代能源方面的应用    王红民;

VPSA技术在干气回收氢气的应用    薛重阳;

乙酸水蒸汽重整制氢催化剂的研究    胡勋;吕功煊;

碳酸钡及其负载催化剂上甲烷氧化偶联反应制C_2烃和氢气    马媛媛;张建生;王瑞燕;庞志成;高志明;

中变气脱碳提氢技术 成功应用    记者 何俊

俄研制出从混合气体中分离出氢气的装置    亿牧

氢气金属化能源潜力无限    本报记者 覃泽文

BP与GE联合开发氢气发电    周勇刚

加强我市充灌氢气球安全 管理 保护人民生命安全    曹亚杰

不能忽视庆典安全    朱凯

可产生大量氢气的绿藻问世    记者　顾钢

能源巨头竞相研究氢能应用    金秋

“火山口”上的铿锵玫瑰    记者 潘国良　通讯员 赵海晶

用玉米和氢气开汽车    记者 李安定

基因改造和驯化细菌利用水葫芦发酵联产氢气和甲烷的机理研究    宋文路

生物质暗发酵和光发酵耦合产氢的机理研究    苏会波

氢气生物学效应系列研究    孙强

L-半胱氨酸对细菌产氢过程的促进作用    谢天卉

不同代谢类型细菌的产氢效能及作用机制研究    张露思

光发酵细菌的选育及其与暗发酵细菌耦合产氢研究    刘冰峰

光合产氢菌群的筛选及其利用猪粪污水产氢因素的研究    尤希凤

高效利用玉米秸秆的产氢菌种及其产氢性能研究    曹广丽

高效利用玉米秸秆的产氢菌种及其产氢性能研究    曹广丽

PDMS/PS中空纤维复合膜回收催化裂化干气中氢气的实验与理论研究    白跃华

长周期光纤光栅氢气传感器研究    季海焦

天然气蒸汽转化—PSA联合制氢中转化反应器模型研究及系统开发应用    贺学文

LaNi_5和活性炭混合物储氢研究    杨志冠

超临界水中生物质气化制氢实验研究    苑塔亮

柴油机掺氢关键技术及实验研究    王斌

变压吸附法净化氢气的研究    陈惊波

气敏传感器用于变压器油中溶解气体在线监测系统的研究    张挺

氢气振荡操作制备宽峰聚乙烯的研究    濮亚俊

柴油机燃用乳化油节油新途径的实验研究    刘闯

V_2O_5/Pd薄膜的制备及氢气敏感特性研究    史勇