酒精—沼气双发酵耦联生态系统的机理和关键技术研究

【摘要】：生物质酒精是发酵工业中最主要的大宗发酵产品之一，其生产过程面临着能耗大、耗水量多和废水处理成本高等突出问题，这在发酵工业中非常具有代表性。而我们依据发酵生态工程学原理建立的“酒精-沼气双发酵耦联生态系统”则有望解决这些问题，并为整个发酵工业的清洁生产提供借鉴。本论文在已有的研究基础上，以推动酒精-沼气双发酵耦联生态系统产业化应用，实现生物质酒精产业可持续发展，丰富发酵生态工程学基本理论并为其在发酵工业的广泛应用架构科学的方法论为目标，建立和评估了玉米酒精-沼气双发酵耦联生态系统，解析了耦联生态系统中厌氧消化微生物群落结构，研究了关键生态因子对耦联生态系统的影响并提出了相应的优化方案，最后对耦联生态系统进行了中试研究。主要研究内容与结果如下： 1.在厌氧消化和酒精发酵效果、物质平衡、酒糟蛋白饲料（DDG）质量、能量核算等方面对建立的玉米酒精-沼气双发酵耦联生态系统进行了评估。循环过程中，酒糟清液的厌氧消化处理稳定高效，各批次酒精发酵正常，且系统在第7批后达到平衡状态。DDG比传统的干磨工艺得到的DDGS具有更高的质量，循环批次所得DDG与第一批DDG在粗脂肪含量和气味上表现出一定的差异。耦联系统的净能量平衡比为1.76，明显高于传统工艺的1.26。 2.利用454焦磷酸测序和实时定量PCR技术解析了玉米酒精-沼气双发酵耦联生态系统中厌氧消化微生物群落结构。高温污泥和中温污泥都表现出丰富的微生物多样性，但二者在结构上存在较大差异，其细菌、古菌和真核生物的丰度比值分别为1005:74:1和523:77:1。高温污泥中检测出的已知细菌菌属有90种，主要分布于Nitrospirae、Chloroflexi、Thermotogae、Proteobacteria、Firmicutes、Bacteroidetes等菌门。中温污泥中有已知细菌菌属106种，主要分布于Chloroflexi、Bacteroidetes、Firmicutes、Proteobacteria、Nitrospirae等菌门。两种污泥共有的细菌菌属有52种。古菌群落中Euryarchaeota（门）在两种污泥中都占有绝对优势，且检测出的10种已知菌属全部属于Euryarchaeota，而高温污泥和中温污泥分别有9和7种，其中丰度最大的菌属为专性乙酸营养型产甲烷菌Methanosaeta。对于真核生物，高温污泥中真菌占已知属的99%，仅有1%左右的原生动物和后生动物，而中温污泥中则以原生动物和后生动物为主（81.4%）。另外，考察饲料中需要检测的致病菌在两种污泥中的存在情况，发现除Shigella（仅占总序列的0.05%）存在于高温污泥中外，其他致病菌在两种污泥中都不存在。 3.研究了氨氮等关键生态因子对酒精-沼气双发酵耦联生态系统的影响。厌氧消化出水中高浓度氨氮促使更多的糖用于酵母生长和甘油合成从而降低了酒精产率，而在液化和灭菌过程中氨氮与还原糖之间的美拉德反应微弱，不会引起发酵体系中总糖的减少。厌氧消化出水中的非氨物质能促进酵母生长，但是不影响酒精产率。因此需要对厌氧消化出水中的氨氮浓度进行控制，且不同的酒精发酵原料，控制的标准不同：对于玉米原料，氨氮的浓度需要控制在300mg·L-1以下，而木薯原料则需为400mg·L-1以下。当厌氧消化出水中氨氮的浓度得到有效控制时，可取代尿素作为酒精发酵的氮源，从而降低额外添加氮源的生产成本。 4.针对影响耦联生态系统的关键生态因子，提出了相应的优化方案并进行了验证研究。首先提出了一种新型的适用于厌氧消化出水的脱氨工艺，并且确定了脱碳过程所需的温度和气液比，采用中心组合设计和响应面分析建立了氨吹脱条件模型。其次，构建了双环形生态系统，确定了系统循环过程中酒糟清液最佳的回用比例为40%，在此情况下消除了硫酸的使用，避免了硫酸盐对系统的影响，并且提高了酒精的产率。最后，提出了酒精-沼气（一级高温厌氧消化）双发酵耦联生态系统以进一步降低投资和运行成本，系统循环过程中，循环批次的酒精发酵速率和酒精产率均高于空白对照，而高温厌氧消化出水中较高的挥发性有机酸和氨基酸浓度是造成这种结果的主要原因，但是高温厌氧消化出水中的悬浮物浓度较大，在实际生产过程中较难去除，因此还需开发经济有效的悬浮物去除方法以实现该系统的应用。 5.分别对玉米酒精-沼气双发酵耦联生态系统和双环形生态系统进行了中试研究以支撑小试实验结果并为后期的产业化应用奠定基础。对于玉米酒精-沼气双发酵耦联生态系统，两级厌氧消化反应器运行正常，酒精发酵罐上进行的循环批次发酵所得的平均酒精度和第一批相当，系统表现出较高的稳定性和自我恢复能力，另外DDG作为饲料添加剂对猪的生长无影响。同步小试酒精发酵结果显示酒精产量与厌氧消化出水中氨氮的浓度紧密相关，进一步说明了系统循环过程中氨氮浓度控制的重要性。在双环形生态系统的循环过程中，无需额外使用硫酸，并且对于厌氧消化出水所需达到的脱氨要求也得到降低。同步小试酒精发酵结果表明混合水配料的酒精发酵平均酒精产量高于空白对照，酒糟的厌氧消化处理过程不受影响。中试成果通过了中国轻工业联合会主持的技术鉴定，鉴定结论：本项目综合技术指标达到国际领先水平。 【关键词】：发酵生态工程学 酒精 厌氧消化 微生物群落结构 生态因子
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：TQ920.6
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-8
• 目录8-11
• 第一章 绪论11-23
• 1.1 发酵工业现状与发展趋势11
• 1.2 生物质酒精11-19
• 1.2.1 生物质酒精发展现状与趋势11-12
• 1.2.2 生物质酒精生产原料与技术12-13
• 1.2.3 生物质酒精面临的问题和相关研究内容13-14
• 1.2.4 生物质酒精生产废水处理技术14-19
• 1.3 生态工程19-20
• 1.3.1 生态工程的产生19
• 1.3.2 生态工程原理19-20
• 1.4 本论文主要研究内容20-23
• 1.4.1 立题依据和研究意义20-21
• 1.4.2 研究内容21-23
• 第二章 玉米酒精-沼气双发酵耦联生态系统的构建与评估23-39
• 2.1 前言23-24
• 2.2 材料与方法24-26
• 2.2.1 菌株和材料24
• 2.2.2 酒精发酵种子培养24
• 2.2.3 酒精发酵培养基制备与发酵24-25
• 2.2.4 酒糟处理25
• 2.2.5 玉米酒精-沼气双发酵耦联生态系统流程25
• 2.2.6 分析方法25-26
• 2.3 结果与讨论26-38
• 2.3.1 循环过程酒糟清液性质与物质平衡分析26-28
• 2.3.2 循环过程两级厌氧消化反应器的运行28-30
• 2.3.3 循环过程酒精发酵30-32
• 2.3.4 酒糟蛋白饲料分析32-36
• 2.3.5 玉米酒精-沼气双发酵耦联生态系统能量核算36-38
• 2.4 本章小结38-39
• 第三章 酒精-沼气双发酵耦联生态系统厌氧消化微生物群落结构分析39-63
• 3.1 前言39-40
• 3.2 材料与方法40-43
• 3.2.1 材料40
• 3.2.2 DNA 提取40
• 3.2.3 16/18S rRNA 基因扩增与 PCR 产物纯化40-41
• 3.2.4 454 焦磷酸测序和生物信息学分析41-42
• 3.2.5 实时定量 PCR 分析42-43
• 3.3 结果与讨论43-62
• 3.3.1 细菌群落分析43-55
• 3.3.2 古菌群落分析55-58
• 3.3.3 真核生物群落分析58-59
• 3.3.4 实时定量 PCR 定量分析污泥样品中微生物59-61
• 3.3.5 高温/中温污泥致病菌分析61-62
• 3.4 本章小结62-63
• 第四章 酒精-沼气双发酵耦联生态系统关键生态因子的研究63-73
• 4.1 前言63-64
• 4.2 材料与方法64
• 4.2.1 菌株和材料64
• 4.2.2 酒精发酵种子培养64
• 4.2.3 酒精发酵培养基制备与发酵64
• 4.2.4 分析方法64
• 4.3 结果与讨论64-72
• 4.3.1 氨氮对酒精发酵的影响64-70
• 4.3.2 厌氧消化出水中非氨物质对酒精发酵的影响70-72
• 4.4 本章小结72-73
• 第五章 酒精-沼气双发酵耦联生态系统的优化73-88
• 5.1 前言73
• 5.2 材料与方法73-75
• 5.2.1 菌株和材料73
• 5.2.2 酒精发酵种子培养73-74
• 5.2.3 酒精发酵培养基制备与发酵74
• 5.2.4 酒糟处理74
• 5.2.5 双环形和酒精-沼气（一级高温厌氧消化）双发酵耦联生态系统流程74
• 5.2.6 厌氧消化出水脱氨74-75
• 5.2.7 分析方法75
• 5.3 结果与讨论75-87
• 5.3.1 厌氧消化出水中氨的脱除75-79
• 5.3.2 双环形生态系统研究79-85
• 5.3.3 酒精-沼气（一级高温厌氧消化）双发酵耦联生态系统85-87
• 5.4 本章小结87-88
• 第六章 酒精-沼气双发酵耦联生态系统中试研究88-97
• 6.1 前言88
• 6.2 材料与方法88-91
• 6.2.1 中试规模与装备88-89
• 6.2.2 中试方案89-90
• 6.2.3 菌株和材料90
• 6.2.4 操作方法90-91
• 6.2.5 分析方法91
• 6.3 结果与讨论91-95
• 6.3.1 玉米酒精-沼气双发酵耦联生态系统中试运行91-93
• 6.3.2 双环形生态系统中试运行93-95
• 6.4 本章小结95-97
• 主要结论与展望97-99
• 创新点99-100
• 致谢100-101
• 参考文献101-116
• 附录：作者在攻读博士学位期间发表的论文116

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