氨氧化古菌的富集及其在污水土地处理系统中的特性

【摘要】：长期以来,氨氧化细菌(Ammonia oxidizing bacteria,简称AOB)被认为是污水处理系统中主要的氨氧化微生物。近年来,研究者在一些环境(包括低溶解氧)中发现了氨氧化古菌(Ammonia oxidizing archaea,简称AOA),并确认了其氨氧化功能,预示了其在污水处理系统中应用的可能性。由于AOA的发现历史较短,对其认识尚十分有限。为此,本文系统研究了AOA的分布条件、富集及其在污水土地处理系统中的特性。目的是深入认识其特性,为其应用奠定基础。采用聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,简称PCR)、克隆文库及定量PCR等分子生物学方法,分析了7个高原农业土壤样品中AOA的丰度分布、群落结构及其生长条件。发现AOA在氨氧化微生物丰度中占据绝对优势,土壤的总氮和有机碳等性质影响AOA群落优势菌株的分布。采用高通量测序技术,分析了16个污水生物处理系统中的微生物群落结构,发现AOA所属泉古菌门占全体微生物的比例为0.01-1.09%;进水类型与水质是影响AOA群落结构的主要因素;此外,较低的溶解氧和较高的盐度有利于AOA生长。分别从土壤和污水处理系统中,富集得到同1种尚未报道的AOA新菌株,命名为SAT1,确定其在系统发育学上属于古菌group I.1a。菌株SAT1细胞呈现不规则球状,直径约为0.5-0.9μm,最大比生长速率为0.021 h-1,最大比氨氧化速率为0.13 fmol N cell-1 h-1。基于全基因组分析,首次在group I.1a的AOA菌株中发现完整的糖异生/糖酵解途径;发现菌株SAT1可水解尿素用于生长,且对诸如高盐度、高温和氧化性损伤等环境压力可能具有潜在的抵抗力。构建了两套土地处理系统。在约560 d的运行期内,系统对高、低等两种污染负荷污水的处理效果良好。基于定量PCR和高通量测序数据,确定系统中所有古菌均可能为AOA,且AOA数量上占据氨氧化微生物优势,并长期保持稳定。基于移动窗口分析发现,AOA群落的动态变化率属轻度水平变化,表明AOA群落结构稳定,保证了系统基本功能的发挥;AOB群落的动态变化率属高度水平变化,表明AOB群落结构不稳定,容易受系统运行条件的影响。基于微生物比氨氮负荷率及自养氨氧化数学模型,结合土壤微宇宙试验和DNA-SIP试验,进一步确定了系统中的AOA具有自养氨氧化功能,也可能存在异养代谢途径。 【关键词】：氨氧化古菌 氨氧化细菌 污水处理系统 富集 高通量测序
【学位授予单位】：清华大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：X703;X172
【目录】：

• 摘要3-4
• abstract4-12
• 第1章 绪论12-41
• 1.1 AOA的发现及生长条件13-22
• 1.1.1 AOA的发现及分类13-16
• 1.1.2 AOA的生长条件16-22
• 1.2 AOA的富集分离及特性22-31
• 1.2.1 AOA的富集分离22-23
• 1.2.2 AOA的生理学及动力学特性23-31
• 1.2.3 AOA的应用研究31
• 1.3 AOA富集的研究方法31-34
• 1.3.1 培养基的选择31-33
• 1.3.2 富集条件的选择33-34
• 1.4 污水处理系统中AOA的研究进展34-39
• 1.4.1 研究成果发表情况34-35
• 1.4.2 具体研究成果介绍35-37
• 1.4.3 未来相关研究的突破口37-38
• 1.4.4 小结38-39
• 1.5 研究目的和内容39-41
• 1.5.1 研究问题的识别39
• 1.5.2 研究目的39
• 1.5.3 研究内容39-40
• 1.5.4 技术路线40-41
• 第2章 氨氧化古菌的研究方法41-61
• 2.1 试验仪器及试剂41-42
• 2.2 样品采集42-44
• 2.2.1 存在条件部分43
• 2.2.2 富集部分43-44
• 2.2.3 污水处理系统监测部分44
• 2.3 理化性质测定44-47
• 2.3.1 预处理方法44
• 2.3.2 测定方法44-47
• 2.4 分子生物学方法47-55
• 2.4.1 样品DNA的提取方法47-48
• 2.4.2 普通PCR及克隆文库48-51
• 2.4.3 质粒提取及定量PCR51-53
• 2.4.4 高通量测序53-55
• 2.4.5 全基因组测序55
• 2.5 数据分析方法55-59
• 2.5.1 高通量测序数据分析方法55-58
• 2.5.2 全基因组测序数据分析方法58-59
• 2.6 AOA富集效果及营养型判定方法59-61
• 2.6.1 富集效果的判定59-60
• 2.6.2 营养型的判定60-61
• 第3章 土壤及污水处理系统中的氨氧化古菌61-91
• 3.1 土壤与活性污泥样品采集61-63
• 3.1.1 土壤样品61-62
• 3.1.2 活性污泥样品62-63
• 3.2 采样点理化性质及环境参数63-64
• 3.2.1 土壤理化性质63
• 3.2.2 污水处理系统环境参数63-64
• 3.3 土壤中AOA的丰度及群落结构64-75
• 3.3.1 氨氧化微生物的丰度特征64-67
• 3.3.2AOA群落结构特性67-75
• 3.4 污水处理系统中AOA的群落结构75-87
• 3.4.1 污水处理系统中AOA的存在性75-76
• 3.4.2 微生物群落结构特性76-81
• 3.4.3 AOA群落结构特性81-87
• 3.5 AOA存在条件识别的意义87-88
• 3.6 AOA富集接种源的确定88-90
• 3.6.1 土壤样品88-89
• 3.6.2 污泥样品89-90
• 3.7 本章小结90-91
• 第4章土壤及污水处理系统中氨氧化古菌的富集策略91-123
• 4.1 富集策略及方法91-98
• 4.1.1 基础培养91-94
• 4.1.2 添加抗生素的富集培养94
• 4.1.3 过膜接种的富集培养94-95
• 4.1.4 综合优化的富集培养95-96
• 4.1.5 检测指标96-98
• 4.1.6 富集培养试验组汇总98
• 4.2 基础培养条件的AOA富集效果98-104
• 4.2.1 土壤基础培养98-101
• 4.2.2 土壤提取细胞基础培养101-103
• 4.2.3 污泥基础培养103-104
• 4.3 添加抗生素对AOA富集的影响104-113
• 4.3.1 添加链霉素对土壤基础培养的影响104-107
• 4.3.2 土壤添加氨苄青霉素培养107-110
• 4.3.3 土壤添加链霉素培养110-112
• 4.3.4 污泥添加链霉素培养112-113
• 4.4 过膜接种对AOA富集的影响113-115
• 4.4.1 基质变化规律113
• 4.4.2 氨氧化微生物富集效果113-115
• 4.5 综合优化条件的AOA富集效果115-122
• 4.5.1 土壤综合优化培养115-120
• 4.5.2 污泥综合优化培养120-122
• 4.6 本章小结122-123
• 第5章 氨氧化古菌的生理代谢行为分析123-147
• 5.1 试验材料与方法123-124
• 5.1.1 AOA富集物富集效果判定123
• 5.1.2 AOA富集物种属鉴定123-124
• 5.1.3 AOA菌株的性质测定及功能预测124
• 5.2 AOA富集效果的判定124-126
• 5.2.1 土壤富集物中的AOA丰度124
• 5.2.2 污泥富集物中的AOA丰度124-126
• 5.3 基于特征基因序列信息的种属鉴定126-131
• 5.3.1 土壤AOA富集物的种属鉴定126-129
• 5.3.2 污泥AOA富集物的种属鉴定129-130
• 5.3.3 AOA菌株种属鉴定分析130-131
• 5.4 AOA菌株SAT1的性质及潜在功能131-146
• 5.4.1 菌株SAT1的性质131-132
• 5.4.2 菌株SAT1的潜在功能132-146
• 5.5 本章小结146-147
• 第6章 污水土地处理系统中微生物丰度及群落结构147-181
• 6.1 试验材料与方法147-150
• 6.1.1 系统设计147-148
• 6.1.2 运行条件148-149
• 6.1.3 参数测定149-150
• 6.2 系统运行效果150-152
• 6.2.1 出水中氮类指标变化规律150-151
• 6.2.2 出水中TOC变化规律151-152
• 6.3 系统中微生物丰度特征152-160
• 6.3.1 古菌和细菌 16S rRNA基因丰度153-154
• 6.3.2 古菌和细菌amoA基因丰度154-158
• 6.3.3 基因丰度比值情况158-160
• 6.4 系统中微生物群落结构特性160-179
• 6.4.1 基因序列与OTUs分组160-162
• 6.4.2 微生物群落结构162-167
• 6.4.3 氨氧化微生物群落结构167-179
• 6.5 本章小结179-181
• 第7章 污水土地处理系统中氨氧化古菌的功能181-196
• 7.1 试验材料与方法181-185
• 7.1.1 统计及数学模型分析方法181-182
• 7.1.2 SAT系统土壤微宇宙试验182-183
• 7.1.3 SAT系统DNA-SIP试验183-185
• 7.2 AOA氨氧化活性的统计及数学模型分析185-190
• 7.2.1 氨氧化微生物最大可承受比氨氮负荷率185-186
• 7.2.2 氨氧化微生物丰度与出水水质的关系186-188
• 7.2.3 SAT系统中AOA活性细胞数188-190
• 7.3 土壤微宇宙中AOA的功能190-192
• 7.3.1 亚硝酸盐和硝酸盐的积累190-191
• 7.3.2 氨氧化微生物丰度变化规律191-192
• 7.3.3 相关性分析及讨论192
• 7.4 DNA-SIP试验中AOA的功能192-195
• 7.4.1 氮类指标浓度192-193
• 7.4.2 AOA自养氨氧化活性193-195
• 7.5 本章小结195-196
• 第8章 结论与建议196-199
• 8.1 结论196-197
• 8.2 建议197-199
• 参考文献199-213
• 致谢213-215
• 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果215

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