两种暖季型草坪草对低温的响应机制及ZjADH基因的克隆与功能分析

【摘要】：日本结缕草及普通狗牙根均为典型的暖季型草坪草,在我国南北地区均有分布。低温伤害是暖季型草坪草在北方地区应用时经常遇到的一种灾害,它不仅会导致草坪草的生长受到损害,甚至会引起植株死亡。研究低温胁迫对暖季型草坪草的伤害机理,探索其抗寒机制具有重要的理论和实际应用意义。ADH基因在植物抵抗逆境胁迫包括低温逆境起着重要的作用,分离并分析日本结缕草ADH基因对于更好的理解结缕草低温响应起着重要的作用。本研究以普通狗牙根和日本结缕草的匍匐茎为材料,研究二者在低温胁迫条件下相关生理指标及分子指标的动态变化,探讨寒冷胁迫对其生理及分子层面的影响；针对抗寒性较强的日本结缕草,设计引物克隆日本结缕草ADH基因全长序列,将其命名为ZjADH,对其进行序列分析和功能分析。研究结果如下：1.低温胁迫下,草坪表观质量下降,两种草坪草的叶绿素含量、类胡萝卜素含量、光化学效率逐渐下降,脯氨酸、可溶性糖及可溶性蛋白逐渐积累,电解质渗透率及丙二醛含量逐渐上升,且低温锻炼能显著降低日本结缕草和普通狗牙根的低温半致死温度。伤害指标评价结果表明日本结缕草抗寒性强于普通狗牙根。2.随着低温胁迫时间的增长,日本结缕草和普通狗牙根的过氧化氢及超氧阴离子含量逐渐增加,SOD和POD活性逐渐升高,APX活性则先升高后降低。CytSOD、 MnSOD、POD、APX基因表达量出现上调,CAT及ChlSOD基因表达量则逐渐下降,FeSOD表达量则先下降再升高。研究表明,低温胁迫下,植株启动抗氧化机制,清除活性氧,降低植物损伤。3.低温胁迫下,两种草坪草的ABA含量呈先升高再降低,CTK含量则逐渐下降。随着胁迫时间的增长,LEA基因表达量逐渐上调,RAB基因表达量先升高再下降。内源激素的变化及低温诱导蛋白的表达对于激活响应机制,提高植株抗寒性具有重要作用。4.设计用于RACE反应的两条引物,进行3'RACE和5'RACE扩增,得到765bp和816bp的片段。通过序列拼接获得该基因的cDNA,序列分析该基因开放阅读框为1140-bp,编码一条含有379个氨基酸的多肽链。将该氨基酸序列进行Blast比较,构建ADH蛋白的系统发育树,发现日本结缕草与沟叶结缕草的ADH亲缘关系最近。克隆的基因为日本结缕草ADH基因,命名为ZjADH, Genbank中登陆号为KT596065。5.通过实时定量RT-PCR方法分析了ZjADH基因在日本结缕草不同组织中转录水平上的表达情况。结果显示,ZjADH基因在根中表达量最高,在叶中表达量最低；ZjADH在低温、干旱和高盐胁迫条件下表达量升高,并且可受到ABA、MeJA和SA信号诱导。6.将含有完整开放性阅读框的ZjADH基因片段插入3302-YFP载体,构建了融合蛋白表达载体ZjADH-YFP,注射法转化烟草叶肉细胞后,利用激光共聚焦显微镜观察发现该蛋白定位于细胞质。7.构建植物表达载体3302-ZjADH,转入到农杆菌GV3101中,通过花序浸泡法,转化野生型拟南芥植株。经草铵膦筛选得到具有草铵膦抗性的幼苗,提取抗性拟南芥叶片DNA,进行PCR检测,证实成功获得转基因植株。提取转基因植株中的总RNA,通过RT-PCR检测,结果显示,转基因拟南芥能够高效表达ZjADH基因。8.对转基因拟南芥进行抗性检测,结果显示：转基因拟南芥植株对低温的抗性明显高于野生型拟南芥；转基因拟南芥中与胁迫相关的基因表达水平明显高于野生型拟南芥植株。对转基因植株进行生理生化分析,结果显示：转基因植物的脯氨酸含量高于野生型拟南芥。本研究表明,低温胁迫下,日本结缕草和普通狗牙根通过渗透调节物质积累、抗氧化代谢、内源激素及低温诱导蛋白的表达,提高植株抗寒性,且日本结缕草抗寒性强于普通狗牙根。以抗寒性较强的日本结缕草为材料,获得了日本结缕草ADH基因,全长1140bp,定位于细胞质,该基因在根中表达量最高,在逆境胁迫条件下,表达量升高显著,成功获得了转基因拟南芥植株,转基因拟南芥对低温抗性与野生型比起来明显提高,初步证明日本结缕草ADH基因与植物逆境响应及抗寒性有关。 【关键词】：日本结缕草 普通狗牙根 低温生理应答 ZjADH基因 功能分析
【学位授予单位】：北京林业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S688.4
【目录】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-7
• 缩略词7-13
• 1 引言13-16
• 2 文献综述16-26
• 2.1 草坪草对低温胁迫的生理生化响应16-21
• 2.1.1 细胞膜透性16-17
• 2.1.2 叶绿素及类胡萝卜素17
• 2.1.3 渗透调节物质17-18
• 2.1.4 光化学效率18-19
• 2.1.5 活性氧19
• 2.1.6 抗氧化酶活性19-20
• 2.1.7 植物内源激素20-21
• 2.2 低温诱导蛋白及抗寒基因21-23
• 2.2.1 低温诱导蛋白21-22
• 2.2.2 抗寒基因22-23
• 2.3 研究目的和内容23-26
• 2.3.1 目的意义23-24
• 2.3.2 研究内容24-25
• 2.3.3 技术路线25-26
• 3 低温胁迫对两种草坪草的伤害评价26-37
• 3.1 试验材料26-28
• 3.1.1 试验材料26-27
• 3.1.2 试验设计及处理27
• 3.1.3 样品采集与保存27
• 3.1.4 数据分析27-28
• 3.2 测定项目及方法28-30
• 3.2.1 草坪质量28
• 3.2.2 电解质渗透28
• 3.2.3 低温半致死温度28-29
• 3.2.4 丙二醛含量29
• 3.2.5 叶绿素及类胡萝卜素含量29
• 3.2.6 PSⅡ光化学效率29-30
• 3.3 结果与分析30-35
• 3.3.1 草坪质量30
• 3.3.2 电解质渗透30-31
• 3.3.3 低温半致死温度31-32
• 3.3.4 丙二醛含量32-33
• 3.3.5 叶绿素及类胡萝卜素含量33-34
• 3.3.6 PSⅡ光化学效率34-35
• 3.4 小结与讨论35-37
• 3.4.1 小结35
• 3.4.2 讨论35-37
• 4 低温胁迫对两种草坪草渗透调节物质的影响37-43
• 4.1 试验材料37-38
• 4.2 测定项目及方法38-40
• 4.2.1 脯氨酸含量38-39
• 4.2.2 可溶性糖含量39
• 4.2.3 可溶性蛋白39-40
• 4.3 结果与分析40-42
• 4.3.1 低温胁迫对脯氨酸含量的影响40
• 4.3.2 低温胁迫对可溶性糖含量的影响40-41
• 4.3.3 低温胁迫对可溶性蛋白含量的影响41-42
• 4.4 小结与讨论42-43
• 4.4.1 小结42
• 4.4.2 讨论42-43
• 5 低温胁迫对两种草坪草抗氧化代谢的影响43-65
• 5.1 试验材料43-45
• 5.2 测定项目及方法45-52
• 5.2.1 活性氧的测定45-46
• 5.2.2 抗氧化酶活性46-47
• 5.2.3 抗氧化酶基因表达47-52
• 5.3 结果与分析52-62
• 5.3.1 活性氧52-54
• 5.3.2 抗氧化酶活性54-56
• 5.3.3 抗氧化酶基因表达56-62
• 5.4 小结与讨论62-65
• 5.4.1 小结62
• 5.4.2 讨论62-65
• 6 低温胁迫对两种草坪草内源激素的影响65-70
• 6.1 试验材料65
• 6.2 测定项目及方法65-67
• 6.2.1 植物茎液提取65
• 6.2.2 标准品的准备65-66
• 6.2.3 测定流程66-67
• 6.2.4 数据处理67
• 6.3 结果与分析67-69
• 6.3.1 脱落酸67-68
• 6.3.2 细胞分裂素68-69
• 6.4 小结与讨论69-70
• 6.4.1 小结69
• 6.4.2 讨论69-70
• 7 低温胁迫对两种草坪草低温诱导蛋白基因的影响70-75
• 7.1 试验材料70
• 7.2 测定项目及方法70-71
• 7.2.1 引物的设计与合成70
• 7.2.2 荧光定量PCR70-71
• 7.3 结果与分析71-73
• 7.3.1 低温诱导蛋白基因qRT-PCR及扩增产物验证71-72
• 7.3.2 胚胎发育晚期丰富蛋白基因72
• 7.3.3 脱落酸应答蛋白基因72-73
• 7.4 小结与讨论73-75
• 7.4.1 小结73
• 7.4.2 讨论73-75
• 8 日本结缕草抗寒基因的克隆及功能分析75-102
• 8.1 日本结缕草抗寒基因的克隆75-85
• 8.1.1 试验材料75-76
• 8.1.2 试验方法76-81
• 8.1.3 结果与分析81-85
• 8.2 ZjADH基因拟南芥转化85-89
• 8.2.1 试验材料85
• 8.2.2 试验方法85-87
• 8.2.3 结果与分析87-89
• 8.3 ZjADH表达及亚细胞定位分析89-95
• 8.3.1 试验材料89-90
• 8.3.2 试验方法90-91
• 8.3.3 结果与分析91-95
• 8.4 ZjADH转基因表型分析95-99
• 8.4.1 试验材料95
• 8.4.2 试验方法95-96
• 8.4.3 结果与分析96-99
• 8.5 小结与讨论99-102
• 8.5.1 小结99
• 8.5.2 讨论99-102
• 9 结论与展望102-104
• 9.1 结论102
• 9.2 创新点102-103
• 9.3 展望103-104
• 参考文献104-110
• 个人简介110-111
• 导师简介111-112
• 获得成果目录112-113
• 致谢113

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