秸秆类生物质暗发酵产氢关键参数优化及其机理研究

【摘要】：氢能因其具有高效、清洁、无污染的特点被公认为最具发展前景的能源之一。在诸多的制氢方法中，生物制氢因其能够在常温常压下操作而备受关注。与光合制氢相比，暗发酵制氢具有产氢速率高、不依赖光照、设备简单、易操作、能够实现废弃生物质资源化等特点而最具产业化前景。目前，该技术普遍存在产氢率低、发酵底物成本高等问题，成为制约暗发酵制氢产业化的主要技术瓶颈。基于此，本文在探寻天然菌源预处理方法的基础上，从高效生物制氢反应器中分离、筛选得到一株底物利用范围广的高效兼性厌氧菌，对其产氢特性进行了研究，并从生化工程的角度对其中的NADH产氢途径进行调控；之后，从降低运行成本的角度，筛选分离在中温条件下能够直接利用未经过预处理的秸秆类生物质高效发酵产氢的微生物，进行菌种鉴定及相关的产氢特性研究。 具体内容如下： 1．探寻新的菌源预处理方式。 系统考察了微波辐射预处理对混合菌源产氢性能的综合影响。结果显示：采用微波辐射对牛粪堆肥进行预处理，能够有效抑制或杀灭嗜氢菌，而保留产氢菌的活性。以20g/L酸解玉米秸秆为底物，利用微波辐射1.5min预处理的牛粪堆肥为菌源，在Na2CO3添加量800mg/L，Fe添加量400mg/L时，产氢量最大，达到144.3ml/g。与其它菌源预处理方式相比，该方法操作安全简单，能耗低，耗时少，且菌源产氢能力更高。 通过AFM，蛋白浓度测定和PCR-DGGE技术研究了微波辐射作用机理在于：微波辐射能够对菌源中微生物细胞壁造成不同程度的损伤和破坏，进而影响微生物细胞的通透性；此外，微波还能对微生物的基因组DNA造成不同程度的损伤，由此导致对微波辐射敏感的嗜氢菌的失活或杀灭；而主要的产氢菌形成的芽孢具有极强的耐辐射和耐热能力，短时的微波辐射不会对其造成损伤，产氢菌的活性得以保持。 2．从生物制氢反应器中分离得到一株高效兼性厌氧产氢菌。首先对其进行形态学特征及生理生化特性研究，结合菌株16S rDNA序列分析，确定该菌株的种属分类。对菌株产氢特性进行研究：菌株Bacillus sp. FS2011能利用多种碳、氮源产氢。以葡萄糖为底物时，最大产氢量为2.26mol/mol。发酵液的初始pH和培养温度对菌株产氢活性有影响，初始pH6.98、35℃为该菌种发酵产氢较为适宜的条件。在单因素实验的基础上，采用Plackett-Burman试验设计法及响应面分析法对菌株Bacillus sp. FS2011发酵产氢条件进行优化。首先采用Plackett-Burman试验设计法筛选出影响菌株产氢的主要因素：葡萄糖浓度、牛肉膏浓度和磷酸缓冲液浓度。在此基础上，利用最陡爬坡路径大致确定最大响应区域，最后利用Box-Behnken试验设计及响应面法进行回归分析。结果表明，三个主要因素的浓度变化显著影响氢气产量。通过求解回归方程，确定最优产氢条件：当葡萄糖浓度13.52g/L，牛肉膏浓度1.95g/L，磷酸缓冲液浓度19.36mmol/L时，氢气产量达到理论最大值3079.0ml/L，实际产氢量达到3081.2ml/L。 3．对Bacillus sp. FS2011中NADH产氢途径进行强化。首先，在培养基中使用与葡萄糖结构类似，氧化还原状态不同的底物作为碳源进行发酵产氢试验，确定FS2011胞内存在NADH产氢途径。 采用丙酮酸脱氢酶系E1抑制剂对菌源产氢过程进行干涉，以期能够充分发挥NADH产氢途径的作用。首先考察了抑制剂浓度对兼性厌氧纯菌和混合菌源发酵产氢量的影响。之后，考察了特定浓度抑制剂的添加对兼性厌氧纯菌和混合菌源产氢性能的综合影响。结果发现，添加适量的抑制剂能够有效提高发酵体系的氢气产量，同时降低体系中乙酸和丁酸等副产物的生成，降低了后续发酵废水的处理难度。 4．从利用生玉米秸秆驯化的生物制氢反应器中分离得到一株能够在中温条件下，不经过底物预处理，高效利用生玉米秸秆发酵产氢的细菌。根据其形态学特征及生理生化特性，并结合菌株16S rDNA序列分析，确定菌株FS3的种属分类。 菌株Clostridium sp. FS3能利用多种碳源产氢。以生玉米秸秆和酸解秸秆为底物时，产氢量分别为73.1和75.3ml/g-cornstalk，初步判断该菌株能够直接利用秸秆中的半纤维素产氢。在单因素实验的基础上，采用响应面分析法对Clostridium sp. FS3发酵产氢培养基进行优化。利用Box-Behnken试验设计及响应面分析法进行回归分析。结果表明，碳酸氢铵、磷酸二氢钾和营养液的浓度变化能够显著影响氢气产量，通过求解回归方程得到如下结论：当生玉米秸秆浓度20g/L，碳酸氢铵浓度1.76g/L，磷酸二氢钾浓度0.91g/L，营养液的添加量为10.4ml/L时，氢气产量达到理论最大值94.1ml/g，实际产氢量达到92.9ml/g。Clostridium sp. FS3作为能够在中温条件下直接利用纤维素类生物质发酵产氢的优良菌种，在生物制氢中有较好的应用前景。 【关键词】：菌源预处理 微波辐射 产氢菌筛选 Bacillus.sp. NADH 生玉米秸秆 Clostridium
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：TQ116.2
【目录】：

• 摘要4-7
• Abstract7-13
• 1 引言13-26
• 1.1 研究背景13-14
• 1.2 研究概况14-20
• 1.2.1 厌氧发酵制备氢气14-16
• 1.2.2 纤维素类生物质在暗发酵制氢中的应用16-18
• 1.2.3 发酵生物制氢研究前沿18-19
• 1.2.4 发酵生物制氢研究中存在的主要问题19-20
• 1.3 本课题的研究目的意义与内容20-22
• 1.3.1 本课题的研究目的和意义20-21
• 1.3.2 主要研究内容21-22
• 参考文献22-26
• 2 微波辐射预处理对天然菌源产氢性能的影响26-46
• 2.1 材料与方法27-32
• 2.1.1 实验材料27
• 2.1.2 实验仪器与设备27-28
• 2.1.3 实验方法28-32
• 2.2 结果与讨论32-43
• 2.2.1 微波辐射时间对菌源产氢性能的影响32-36
• 2.2.2 微波辐射影响菌源产氢性能的机理分析36-41
• 2.2.3 生长因子对发酵产氢的影响41-43
• 2.3 结论43-44
• 参考文献44-46
• 3 高效产氢菌的筛选鉴定及其产氢特性研究46-71
• 3.1 材料与方法46-50
• 3.1.1 实验材料46-47
• 3.1.2 实验仪器与设备47-48
• 3.1.3 实验方法48-50
• 3.1.4 分析方法50
• 3.2 结果与讨论50-68
• 3.2.1 发酵产氢细菌的分离、筛选与鉴定50-53
• 3.2.2 高效产氢菌 Bacillus sp. FS2011 的产氢特性研究53-61
• 3.2.3 响应面法优化发酵产氢条件61-68
• 3.3 小结68-69
• 参考文献69-71
• 4 丙酮酸脱氢酶系 E1 抑制剂对菌源产氢性能的影响71-88
• 4.1 材料与方法71-75
• 4.1.1 试剂71
• 4.1.2 培养基71-72
• 4.1.3 实验仪器与设备72-73
• 4.1.4 实验方法73-75
• 4.2 结果与讨论75-86
• 4.2.1 酶循环反应体系的建立75-77
• 4.2.2 辅酶的提取方法77-78
• 4.2.3 不同氧化还原态底物对 Bacillus sp. FS2011 产氢性能的影响78-79
• 4.2.4 阻断代谢途径以提高菌源的产氢量79-82
• 4.2.5 抑制剂对菌源产氢性能的影响82-86
• 4.3 小结86
• 参考文献86-88
• 5 直接利用生秸秆高效发酵产氢菌的筛选分离及产氢特性研究88-106
• 5.1 材料与方法89-92
• 5.1.1 实验材料89
• 5.1.2 实验仪器与设备89-90
• 5.1.3 实验方法90-91
• 5.1.4 分析方法91-92
• 5.2 结果与讨论92-104
• 5.2.1 直接利用秸秆类纤维质发酵产氢细菌的分离、筛选与鉴定92-94
• 5.2.2 菌株 FS3 的产氢特性94-99
• 5.2.3 响应面法优化产氢培养基99-104
• 5.3 小结104
• 参考文献104-106
• 6 结论106-108
• 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果108-109
• 个人简历108
• 攻读博士学位期间发表的学术论文108-109
• 致谢109

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