秸秆五、六碳糖共发酵产琥珀酸的菌株分离、选育及代谢研究

【摘要】：琥珀酸作为最重要四碳二元羧酸,被广泛用于制备1,4-丁二醇、四氢呋喃、γ-丁酯、苯基化合物、生物材料聚合体PBS等化学品。到目前为止,琥珀酸的制备主要是采用基于石化资源的马来酸酐法。随着石化资源的日趋枯竭,研究利用生物质发酵法制备琥珀酸倍受人们重视。在生物质转化利用方面,发酵法制备燃料乙醇的研究是主要热点之一,然而考虑到琥珀酸发酵具有固定二氧化碳的特征,其理论转化率超过100%,所以,一旦技术难题得到解决,生物质发酵制备琥珀酸比燃料乙醇具有显著的经济性优势。本文通过分离筛选得到一株基于秸秆五、六碳糖共发酵制备琥珀酸的菌株,并对其代谢及发酵做了重点研究,以望为建立一个基于秸秆生物质转化制备琥珀酸的绿色平台提供技术支持。形成主要结论如下: (1)分离得到约300株细菌,这些菌株与常规的瘤胃菌具有基本相似的特征,多数为兼性或专性厌氧菌,初步发酵显示菌株S.JST具有良好的发酵潜力。通过基本的生理生化鉴定发现菌株与放杆菌属较接近,进一步的API试验表明菌株与产琥珀酸放线杆菌种较接近,于是进行16S r RNA试验并提交到GenBank(EF044771.1),本菌株的16S r RNA与Actinobacillus succinogenes 130Z菌株的16S r RNA同源性为99%,可确定本菌株为产琥珀酸放线杆菌,命名为A.succinogenes S.JST。 (2)通过中间体及抑制剂分析初步确定菌株能够同时利用葡萄糖和木糖,以及琥珀酸来自草酰乙酸的两步氢化所得。进一步的酶活及相关酶基因序列分析细化了细胞整体代谢的各个途径与支路,在代谢途径分析的基础上,列出相关代谢方程,并进一步给出代谢通量方程,即初步构建菌株的代谢网络。利用构建的代谢网络计算代谢通量,通量分析显示琥珀酸途径磷酸烯醇式丙酮酸转化为草酰乙酸进一步转化为琥珀酸,其流量最大,乙酸及乙醇作为主要的副产物占据了乙酰辅酶A的主要代谢支流,且节点分析表明该处节点为柔性节点,适于进一步的改造。(3)在将氟乙酸转变为氟乙酰辅酶A并进而转变为氟柠檬酸方面,磷乙酰转移酶扮演着重要角色,而一旦形成氟柠檬酸则容易造成细胞的致死效应,这最终导致了出发菌株不能够在氟乙酸平板生长,因此那些易于生长的突变株可能就是在围绕磷乙酰转移酶的途径发生了突变,基于此原理,本试验筛得一株突变株。对突变株及出发菌株分别做了PTA酶活及基因对比分析,结果表明PTA酶活降低了以及由此引起了乙酸的降低,同时发现乙酸与琥珀酸流量同时降低,乙酸流量的降低没有引起琥珀酸的升高反促其降低,这看似难以解释,然而进一步的代谢途径分析发现,理论上在葡萄糖转化为琥珀酸的过程中生成的H还原力满足不了琥珀酸合成所需,可这种矛盾却能被乙酸的代谢所缓解,这是由于1摩尔乙酰辅酶A转化为乙酸过程中净增2摩尔NADH,这大大缓解了细胞内H供体不足的矛盾,反之,突变株乙酸流量的降低则加剧了H供体不足的矛盾,因此应对本突变株进行其他方式的调控以及进行乙醇降低选育。 (4)通过定点筛得到一株乙醇代谢缺陷的复合突变株,由于在乙醇脱氢酶基因中间成功引入了“TAA”终止密码子,乙醇脱氢酶酶活显著降低,流量分析显示乙醇流量明显降低以及琥珀酸流量得到了一定提升。由于细胞仍处于H还原力不足的状态,琥珀酸上升的程度远低于乙醇降低的程度,对于复合突变株而言,由于H电子供体平衡没有得到根本改善,其生产琥珀酸潜力没有得到彻底挖掘,因此应做进一步的代谢调控。 (5)通过氢气、ORP以及EMP/HMP流量比的调控,围绕H电子供体的代谢得到了很好地平衡,因此琥珀酸的流量最终得到了显著的提升。同时,当采用碳酸镁代替碳酸钙作为发酵过程中和剂时,作为五碳糖木糖代谢关键酶的木酮糖激酶被进一步激活,这最终促进了五、六碳糖的共发酵。 (6)在单因素试验基础上的正交试验结果表明主要的离子及生物素浓度(mmol/L)采用如下条件时产酸较佳:镁离子6.0、锰离子0.9、亚铁离子0.6、锌离子1.5、V_(B2) 0.005、V_(B5) 0.012、V_(B14) 0.003及V_(B12) 0.01。进一步的神经网络分析表明,当最佳条件为二氧化碳体积含量67%、氢气4.8%及生物素浓度5.9mmol/L时,发酵产酸明显提高,同时对比分析表明,与响应曲面的回归分析相比,神经网络具有更高的仿真及预测能力。 (7)通过线性及非线性模型分析了菌体生长动力学及产物合成动力学,结果表明非线性模拟能够比较精确的反应发酵过程中的菌体生长及产物合成。最终表明所得到菌体生长动力学模型及产物合成动力学模型分别为: 【关键词】：产琥珀放线杆菌 代谢通量 选育 H电子供体 发酵动力学
【学位授予单位】：合肥工业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：TQ921
【目录】：

• 摘要8-10
• Abstract10-13
• 致谢13-24
• 第一章 绪论24-40
• 1.1 琥珀酸的性质24
• 1.1.1 琥珀酸的物理性质24
• 1.1.2 琥珀酸的化学性质24
• 1.2 琥珀酸的应用24-25
• 1.2.1 琥珀酸在化学品领域的应用24-25
• 1.2.2 琥珀酸在食品领域的应用25
• 1.2.3 琥珀酸在医药卫生领域的应用25
• 1.3 琥珀酸的生产方法25-26
• 1.3.1 琥珀酸的化学法制备25
• 1.3.2 琥珀酸的生物法制备25-26
• 1.4 琥珀酸的微生物发酵研究进展26-30
• 1.4.1 菌种分离筛选方面27
• 1.4.2 菌种关键酶分析方面27
• 1.4.3 代谢工程及其在琥珀酸产生菌中的应用研究27-28
• 1.4.4 菌种选育方面28
• 1.4.5 生物质发酵及调控方面28-30
• 1.5 需要解决的科学问题30
• 1.6 研究内容30-31
• 1.7 研究结果应用前景31
• 1.8 研究的课题来源31
• 1.9 本文研究思路31-33
• 参考文献33-40
• 第二章 菌株的分离、鉴定及初步发酵40-53
• 2.1 前言40
• 2.2 材料与方法40-44
• 2.2.1 主要仪器与试剂40-41
• 2.2.2 菌种分离41-42
• 2.2.3 菌种鉴定42-44
• 2.2.4 菌种初步发酵44
• 2.3 结果与分析44-50
• 2.3.1 菌种分离44-45
• 2.3.2 菌种鉴定45-50
• 2.3.3 菌种初步发酵50
• 2.4 结论50-52
• 参考文献52-53
• 第三章 原始菌株的代谢分析53-73
• 3.1 前言53
• 3.2 材料与方法53-58
• 3.2.1 主要仪器与试剂53
• 3.2.2 碳源利用分析53-54
• 3.2.3 丙二酸对酶的竞争性抑制分析54
• 3.2.4 氟乙酸抑制分析54
• 3.2.5 相关酶活分析54-57
• 3.2.6 相关酶基因分析57
• 3.2.7 代谢底物检测57
• 3.2.8 代谢产物检测57
• 3.2.9 代谢通量分析57-58
• 3.2.10 代谢节点分析58
• 3.3 结果与分析58-69
• 3.3.1 木糖利用结果分析58-59
• 3.3.2 酶活分析方法的建立59
• 3.3.3 丙二酸对酶的竞争性抑制分析59-60
• 3.3.4 氟乙酸抑制分析60
• 3.3.5 相关酶活分析60-61
• 3.3.6 相关酶基因分析61-63
• 3.3.7 代谢通量分析63-69
• 3.3.8 代谢节点分析69
• 3.4 结论69-70
• 参考文献70-73
• 第四章 降低乙酸副产物选育73-84
• 4.1 前言73-74
• 4.1.1 诱变方法73
• 4.1.2 突变株的筛选73
• 4.1.3 突变株的表征73-74
• 4.2 材料与方法74-75
• 4.2.1 主要仪器及试剂74
• 4.2.2 发酵培养74
• 4.2.3 筛选培养基74
• 4.2.4 糖检测74
• 4.2.5 有机酸检测74
• 4.2.6 磷乙酰转移酶酶活检测74
• 4.2.7 ~(60)Co γ辐射诱变74
• 4.2.8 Pta途径缺陷型菌株的筛选74-75
• 4.2.9 突变基因的序列分析75
• 4.3 结果与分析75-82
• 4.3.1 ~(60)Co γ射线对菌株的致死曲线75-76
• 4.3.2 突变株的筛选76-78
• 4.3.3 突变株与出发株的乙酸生成比较78-79
• 4.3.4 突变株与出发株的琥珀酸生成比较79
• 4.3.5 突变株与出发株的整体代谢通量比较79-81
• 4.3.6 突变株与出发株的磷乙酰转移酶酶活比较81-82
• 4.3.7 突变株与出发株的磷乙酰转移酶基因分析82
• 4.4 结论82-83
• 参考文献83-84
• 第五章 降低乙醇副产物选育84-93
• 5.1 前言84-85
• 5.2 材料与方法85-86
• 5.2.1 主要仪器及试剂85
• 5.2.2 培养基85
• 5.2.3 乙醇脱氢酶基因克隆85
• 5.2.4 乙醇脱氢酶基因测序85
• 5.2.5 乙醇脱氢酶基因体外定点突变85
• 5.2.6 乙醇脱氢酶突变基因胞内重组85
• 5.2.7 突变株的筛选85-86
• 5.2.8 突变株的突变基因表征86
• 5.2.9 突变株的乙醇脱氢酶酶活测定86
• 5.2.10 突变株的代谢糖测定86
• 5.2.11 突变株的代谢有机酸测定86
• 5.3 结果与分析86-91
• 5.3.1 adh基因的克隆测序86-87
• 5.3.2 adh基因的定点突变及胞内重组87-88
• 5.3.3 阳性突变株的筛选88
• 5.3.4 突变株的乙醇脱氢酶基因及酶活88-89
• 5.3.5 突变株的代谢通量89-91
• 5.4 结论91-92
• 参考文献92-93
• 第六章 突变株的代谢调控93-107
• 6.1 前言93-94
• 6.2 材料与方法94-95
• 6.2.1 主要仪器及试剂94
• 6.2.2 发酵培养基94
• 6.2.3 代谢平衡分析94
• 6.2.4 H_2调控H供体平衡94
• 6.2.5 ORP调控细胞O/R平衡94
• 6.2.6 EMP/HMP流量比调控94-95
• 6.2.7 五、六碳糖共发酵调控95
• 6.2.8 转氢酶基因分析95
• 6.2.9 转氢酶酶活分析95
• 6.2.10 磷酸果糖激酶、6-磷酸葡萄糖脱氢酶及代谢通量分析95
• 6.3 结果与分析95-105
• 6.3.1 代谢平衡分析95-96
• 6.3.2 H_2调控结果96-98
• 6.3.3 ORP调控结果98-100
• 6.3.4 转氢酶基因及酶活分析(EMP/HMP流量比调控可行性分析)100-101
• 6.3.5 EMP/HMP流量比调控结果101-103
• 6.3.6 五、六碳糖共代谢调控结果103-105
• 6.4 结论105-106
• 参考文献106-107
• 第七章 突变株的发酵条件优化107-122
• 7.1 前言107
• 7.1.1 发酵条件107
• 7.1.2 优化方法107
• 7.2 材料与方法107-109
• 7.2.1 主要设备、试剂、及发酵检测107-108
• 7.2.2 主要因素考察108
• 7.2.3 培养基优化正交设计108
• 7.2.4 代谢调控因子的响应曲面优化设计108-109
• 7.2.5 神经网络模型的建立109
• 7.3 结果与分析109-119
• 7.3.1 培养基优化正交试验109-112
• 7.3.2 代谢调控因子的响应曲面优化设计112-117
• 7.3.3 神经网络分析117-119
• 7.4 结论119-121
• 参考文献121-122
• 第八章 发酵动力学122-139
• 8.1 前言122
• 8.1.1 发酵动力学研究内容122
• 8.1.2 发酵动力学模型122
• 8.2 材料与方法122-123
• 8.2.1 基本设备、试剂、发酵及检测122
• 8.2.2 发酵动力学模型分析方法122-123
• 8.3 结果与分析123-137
• 8.3.1 菌体生长动力学分析123-133
• 8.3.2 产物合成动力学分析133-137
• 8.4 结论137-138
• 参考文献138-139
• 第九章 结论与展望139-142
• 9.1 研究的主要结论139-140
• 9.2 论文的创新点140
• 9.3 展望140-142
• 学位期间参加的相关研究内容142-143

您可以在本站搜索以下学术论文文献来了解更多相关内容

生物可降解高分子材料及其在药物释放中的应用    刘凤兴,程为庄

琥珀酸放线杆菌发酵培养基的优化    郑璞;朱蕾蕾;刘宇鹏;徐敏;孙志浩;

大豆秸秆酶水解及L-乳酸发酵    徐忠,汪群慧,姜兆华

柠檬酸钠对肌苷发酵过程代谢流分布的调节    陈双喜,黄明志,储炬,庄英萍,张嗣良

红球菌DS-3脱硫发酵动力学模型的建立    马挺;李京浩;李国强;梁凤来;刘如林;

利用甘蔗糖蜜半连续发酵生产琥珀酸    董晋军;郑璞;孙志浩;倪晔;刘宇鹏;

~(60)Coγ辐射对毛竹种子活力及早期幼苗生长的影响    蔡春菊;高健;牟少华;

~(60)Coγ射线诱变阿维拉霉素筛选高产菌株及培养基优化    梁新乐;陈敏;张虹;胡奇杰;

羊肚菌胞外多糖发酵动力学模型    武秋立,安家彦

基于BP神经网络的鸡蛋新鲜度无损检测方法    王巧华;任奕林;文友先;

美国大学微生物学教学的特点与思考    王子迎;

海洋青霉(Penicilliumsp.)FS010441的形态学观察和产纤维素酶性质初步研究    游银伟,汪天虹,岳寿松

不同萌发期绿豆芽蛋白质含量的测定及营养价值分析    李瑞国;朱秀敏;杨慧;

家蚕血淋巴蛋白的发育变化和BmLSP的纯化    葛宏华,孙莉宁,张其瑞

二甲亚砜对水稻浸种及苗期的后续效应研究    孔小卫,李坤,江洪波

鸡脑P物质的制取及分析    刘晓颖,丁毅

热击对水稻(O.sativaL.)叶绿素a,b及POR同功酶的效应    朱华庆,陈飞,谢惠安,张萍

元素硫微量分析综述    钱胜涛,肖安陆,胡典明,孔渝华

丁二酸合成研究进展    薛锋;

巢湖地区菠菜中有机磷农药残留状况调查    徐国;

有机废水制取生物塑料的动力学分析    王进;俞汉青;

基于模糊神经网络α阶逆系统的发酵过程多变量解耦控制    孙玉坤;王博;丁慎平;

针对时滞系统的RBF神经网络滑模控制策略    王亚慧;程培新;赵亚丹;张桐;

混合肉肌原纤维蛋白特性研究    周亚军;康建波;刘妍菊;苏丹;马龙彪;

基于BP神经网络的温室番茄光合作用速率预测模型研究    王伟珍;刘春红;张漫;李民赞;刘刚;

基于自组织映射神经网络的舰艇系统冲击损伤决策    蒋丰;冯奇;

区域似大地水准面精化模型算法的优选    雷伟伟;郑红晓;陈虎;

一种理想的能源植物——菊芋    曹海龙;周正;李曙光;白雪芳;杜昱光;

沼气研究和利用的现状与发展趋势    赵新波;祝诗平;

普洱茶及其原料多糖分子组成及光谱学特性研究    龚加顺;胡小静;彭春秀;周红杰;

榛子杂交后代的遗传分析与良种选育研究    李秀霞

PAMAM基树状分子的制备及其在溶液中聚集与界面的作用机制    杨惠

东祁连山高寒草地土壤真菌多样性研究    张俊忠

单增李斯特菌鸡卵黄抗体的抑菌性能及其机理研究    隋建新

酒明串珠菌不对称合成手性醇及其反Prelog脱氢酶的酶学特性研究    孟凡涛

富苯丙氨酸碱性短肽的发现及其对蛋白质等电点和免疫交叉反应的影响    徐军

有限精度权值神经网络优化的研究与应用    包健

海洋灰绿曲霉发酵生产灰绿霉素及真菌聚酮合成酶基因Tspks1的异源表达    蔡孟浩

基于MMOI方法的电信客户流失预测与挽留研究    罗彬

日盲型紫外探测和直升机着舰光电助降技术的研究    杨承

可溶性鸡蛋壳膜蛋白与多肽的制备及其抗氧化活性的研究    周艳华

产聚半乳糖醛酸酶菌株的筛选、发酵条件及酶学性质的研究    胡慧磊

高产胞外多糖乳酸乳杆菌的选育及其发酵条件的优化    陈若雯

产金黄色葡萄球菌肠毒素A工程菌构建及其发酵条件研究    丁岚

基于电子鼻的鱼粉新鲜度快速检测方法研究    刘辉

中度嗜盐菌新种Pontibacillus yanchengensis sp. nov.的鉴定与多相分类学研究    杨砚

嗜热链球菌抗噬菌体菌株的选育、培养及冻干发酵剂的研究    冷一非

桃蚜的抗药性监测、杀虫剂的配方筛选及其增效生化机理的研究    申君

刺糖多孢菌对剪切力抗性的初步研究    谢宙

沼液作为生菜、柑橘叶面肥的试验研究    袁怡

聚己内酯的表面光化学接枝改性以及细胞相容性    竺亚斌,高长有,计 剑,沈家骢

聚乳酸及聚乙二醇改性聚乳酸体外降解研究    任建敏,邹全明,王缚鲲,张玮

生物降解聚合物的研究概况及应用前景    肖荔人

反相HPLC同时测定产琥珀酸放线杆菌发酵液中的有机酸与葡萄糖    白冬梅,杜国民,沈菲,付卫明,赵学明,李鑫钢,徐世民

反相高效液相色谱法测定糠酸、糠醇和糠醛    石起增;杨光瑞;刘巧茹;

可控生物降解释药材料的设计与研究    萧聪明,朱康杰

PCL-PEG-PCL嵌段共聚物的合成与性能    赵三平,尹玥,冯增国

聚乳酸-聚乙二醇-聚乳酸三嵌段共聚物的降解性能    全大萍,高建文,廖凯荣,卢泽俭

撑篙竹×大绿竹杂交选育的研究    宁材强，戴启惠

乳酸的工业化生产、应用和市场    钱志良,胡军,雷肇祖

麻竹不同地理群体遗传变异分析及良种选育研究    邢新婷

复合诱变选育腈水合酶高产菌株    朱婷婷;秦智;孙晓君;蒋忠平;

肌苷发酵过程的动力学研究    汪叔雄;林红缨;张兵;吕德伟;

金褐霉素高产菌株的推理选育    王华;高勇生;

海洋低温BS070623菌株选育及其发酵培养基优化(Ⅰ)    王晓辉;窦少华;迟乃玉;张庆芳;

高产类胡萝卜素菌株的选育    翟红梅;肖冬光;张坤生;李贤宇;

高生物量富硒酵母菌的选育    张顺涛;李肖;左涛;管斌;荀娟;李珊;

选育高产纤维素酶菌种的研究进展    李雪峰;侯红萍;

细菌L-乳酸发酵的研究——耐高糖高酸菌株的选育    刘勇军,王昌禄,曹伟锋,乐晓洁,于志萍

产果糖基转移酶米曲霉菌株的选育    何熙璞;张敏;蒋勇才;李俊芳;王邕;姚评佳;魏远安;

丁二酮高产菌株的选育及发酵动力学分析    赵玲;王静云;包永明;付怡;刘伯实;安利佳;

酿酒酵母YS2-△adh2-△ald6突变株的构建及hxt1基因的过表达    王艳尊;高媛媛;施巧琴;吴松刚;黄建忠;

金灰青霉H4的链霉素抗性突变株新产抗肿瘤产物研究    田从魁;崔承彬;李长伟;

产紫青霉G59的链霉素抗性突变株新产抗真菌产物研究    田从魁;崔承彬;李长伟;

莱茵衣藻(Chlammydomonas reinhardtii)野生型和不同突变株对NaCl抗性检测分析    古力孜拉;史博;热依汗古丽;吾甫尔·米吉提;

突变株的构建及其生物学特性研究    王长军;董瑞萍;潘秀珍;王晶;唐家琪;

酵母菌细胞自溶突变株的研究    何秀萍;刘增然;刘春秀;张博润;

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌毒素apxII基因无药物抗性标记突变株HBC~-／GFP~+的构建及其生物学特性研究    贝为成;何启盖;方六荣;金梅林;周锐;陈焕春;

伪狂犬病毒UL14基因缺失影响病毒的增殖和细胞间扩散    张辉;肖少波;方六荣;赵骞;薛念波;陈焕春;

人类偏肺病毒F蛋白糖基化位点对其体内外复制能力的影响    张金辉;窦颖;佘薇薇;赵耀;刘平;赵晓东;

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌武汉株apxⅡ~-/Amp~r突变株的构建及其安全性和保护性测定    贝为成;何启盖;陈焕春;徐晓娟;洪文洲;方六荣;肖少波;宋云峰;

营造人才成长的丰厚土壤    本报记者　吴长锋 通讯员　张瑾

高校自主创新需找准定位    本报记者 吴长锋

以制度创新推进高水平大学建设    通讯员 张瑾 本报记者 王建东

传承·演进·创新    本报记者 吴长锋

特色与质量：大学的生命力和竞争力（下）    通讯员 张瑾 本报记者 王建东

我市与合肥工业大学签署全面合作协议    王翠竹

合肥工业大学：积极推进学生实践能力的培养    魏娜

智力支撑著华章    本报通讯员　 张瑾 本报记者　 陈婉婉

推进科技创新 实现市校共赢    本报记者 王枫

找出自身经管之道    本报记者 刘蓓蓓

秸秆五、六碳糖共发酵产琥珀酸的菌株分离、选育及代谢研究    李兴江

~（13）C代谢通量分析平台的建立与改良    申铁

新型纤溶酶得产生菌选育、发酵优化及酶学性质研究    范晓丹

离子注入生防菌Bs-916高效突变菌株选育及其拮抗作用分子机理研究    李德全

固氮斯氏假单胞菌四碳二羧酸转运基因的功能鉴定及表达调控研究    李红权

大豆异黄酮糖苷的超临界流体萃取及固定化酶转化研究    潘利华

高产琥珀酸大肠杆菌的代谢工程    王庆昭

基于代谢工程理论构建酵母菌株提高乙醇产量的研究    曹利民

集成视觉系统中旋转对称三角传感器的光学与机械学设计方法研究    ECKSTEIN Johannes

白囊耙齿菌高产菌株选育、发酵、胞内多糖分离纯化及生物活性研究    张娜

黑曲霉产β-葡萄糖苷酶优良菌株的Co～（60）辐射诱变选育及发酵特性研究    王贵娟

米根霉产L-乳酸优良菌株的同步辐射诱变选育及发酵特性研究    肖小发

高产酒精酵母的选育及发酵工艺条件与动力学研究    范元发

基因组改组技术选育高产琥珀酸的琥珀酸放线杆菌    张坤坤

短小芽孢杆菌生物合成D-核糖及代谢通量分析的研究    于志萍

产琥珀酸大肠杆菌代谢工程的研究    吴婵媛

应用基因组改组选育    徐敏

肌苷生产菌的摇瓶发酵条件优化及代谢通量分析    杨尚彤

耐高温乳酸菌的选育及应用研究    崔国艳

琥珀酸工程菌的发酵优化及E.coli TUQ13中心碳代谢的~（13）C通量分析    刘子鹤