纤维素功能菌群及其木薯酒糟高效甲烷发酵技术的研究

【摘要】：含有大量木质纤维素的木薯渣是木薯酒糟厌氧消化过程中的主要底物,它的不溶性和复杂性使其难于降解,因此木薯渣的高效水解是提高木薯酒糟厌氧发酵性能和产甲烷效率的关键。近年来,随着纤维质底物协同降解机理的研究,开发高效木质纤维素分解复合菌群对于木薯渣、甘蔗渣等工农业废弃物残渣向甲烷、氢气、酒精等高附加值产品转化具有重要的价值。 本文通过底物限制性培养技术得到一组能够高效降解纤维质的功能菌群RXS,该菌群能够在40h内将滤纸和木薯渣降解明显,CMC酶和木聚糖酶活力分别为38.5U和90.2U。连续传代、-80℃冷冻保存半年和90℃高温处理20min后,该菌群对底物的降解效果和酶活力表达基本不变,表明该菌群稳定性良好;利用PCR-DGGE技术分析不同代时的微生物结构并进行初步鉴定。结果发现条带基本不变,一些兼性微生物(Beta proteobacterium HMD444)、厌氧微生物(Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum strain M18, Therm -anaerovibrio acidaminovorans DSM 6589, and Clostridium sp.strains LDC-8-c12, 5-8, CO6- 72, etc.)和不可培养细菌良好的共存于此体系中。 对该菌群的酶活表达及其关键水解酶的酶学特性分析表明,该菌群分泌的胞外水解酶是一组包含木聚糖酶、CMC酶、β-葡萄糖苷酶、微晶纤维素酶、滤纸酶和果胶酶等的多酶复合体系;CMC酶和木聚糖酶的最适反应温度、pH和酶促反应时间分别为60℃、6.0和10min;温度和pH稳定性较好;同时发现Mn~(2+)对两种酶具有激活作用,Fe~(2+)、Cu~(2+)和SDS具有抑制作用。而Mg~(2+)对CMC酶有抑制作用,对木聚糖酶有促进作用。吐温-80、曲拉通-100、EDTA、K~+、Ca~(2+)、Li+、Ba~(2+)等对CMC酶和木聚糖酶活力影响不明显。 在该菌群应用于木薯渣的水解过程中,监测发现CMC酶、木聚糖酶、果胶酶等关键酶的酶活力分别在第2～3d达到最大值34.4、80.5和15.8U;经过10d的发酵后,木薯渣中的纤维素、半纤维素及木质素分别降解了79.8%、85.9%和19.4%,且木薯渣的失重高达61.5%;此外,代谢产物主要是乙酸、丁酸、己酸和甘油;而溶解性COD、总糖和总挥发酸的变化表明第2d时木薯渣的水解率最高。培养基及其培养条件对复合菌群发酵性能的影响分析表明,复合菌群能够更好的分解滤纸、棉花等纤维素;而以木薯渣为唯一碳源时,20g/L的添加量分解效率最佳;利用蛋白胨和酵母粉做氮源时的纤维素分解活性远高于硝酸铵、尿素等无机氮源;在发酵温度、接种体积分数、初始pH、转速分别为50~60℃、5~10%、5.0~9.0和75~135r/min的范围内,菌群RXS对纤维质底物的分解能力较强。上述结果表明,该菌群能够有效地水解木薯燃料酒精生产过程中的废弃物—木薯渣,并有望用于木薯渣高效沼气发酵的前处理中。 在有效体积为3L的水解反应器(CSTR)和13L的高温厌氧反应器(ASBR)中,考察了菌群RXS和高温厌氧出水循环耦合对木薯酒糟水解、产甲烷的影响。结果表明在木薯酒糟废液与高温消化液的比例为1:2、通气量为0.25vvm的水解条件下,经过24h的水解,出水TVFA(乙酸)含量由最初的0.89 g/L累积到3.57 g/L,水解液的累计甲烷产量相比处理0h时提高了17.7%,产气速率也明显升高。分析了不同OLR的木薯酒糟单相和两相甲烷发酵的产甲烷阶段的运行状况,结果表明单相厌氧发酵时,OLR在12.0gCOD.L-1.d-1的范围内,COD去除率在70%左右,TVFA/Talk在0.37附近波动,比产甲烷速率为0.115L CH4/g COD。两相发酵时,OLR在20.0gCOD.L-1.d-1范围内,COD去除率在75%左右,TVFA/Talk在0.20以下,比产甲烷速率为0.128L CH4/g COD。而高于这些OLR时,出水出现酸化现象,反应器运行不正常。这些结果表明通过纤维质水解功能菌群强化木薯渣水解过程的两相沼气发酵工艺,可以提高甲烷产量,并且使产甲烷阶段高效稳定运行,出水中可能含有更少的酒精发酵抑制物质。 【关键词】：木薯渣 水解功能菌群 关键酶活 发酵性能 生物强化 两相沼气发酵
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：TS261.9
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-7
• 目录7-10
• 第一章 绪论10-22
• 1.1 发展木薯燃料乙醇的意义及其木薯酒糟的资源化研究10-12
• 1.1.1 发展木薯燃料乙醇的意义及其酒糟废液问题10
• 1.1.2 木薯酒糟废液的传统处理方法10-11
• 1.1.3 木薯酒精制造新工艺-木薯酒精沼气双发酵生态耦联工艺及其存在的问题11-12
• 1.2 纤维质废弃物沼气发酵的机理及其高效沼气发酵技术研究12-16
• 1.2.1 纤维质底物沼气发酵的机理12-13
• 1.2.2 高效厌氧反应器的研究13-14
• 1.2.3 沼气发酵的过程控制与优化14-15
• 1.2.4 纤维质底物高效厌氧消化工艺的研究15-16
• 1.3 纤维质废弃物水解强化技术研究16-17
• 1.3.1 纤维质水解的物理强化16
• 1.3.2 纤维质底物水解的化学强化16-17
• 1.3.3 纤维质底物水解的生物强化17
• 1.4 纤维质水解微生物资源及其水解酶系统的研究17-20
• 1.4.1 纯培养微生物的研究17-18
• 1.4.2 纤维质分解复合菌群的研究18-19
• 1.4.3 纤维素水解机理及其水解酶复合体系的研究19-20
• 1.5 本论文的研究意义与主要内容20-22
• 1.5.1 研究意义20-21
• 1.5.2 本论文的主要研究内容21-22
• 第二章 材料与方法22-32
• 2.1 实验材料22-24
• 2.1.1 主要实验仪器22
• 2.1.2 主要实验药品22-23
• 2.1.3 实验原料23-24
• 2.1.4 甲烷发酵流程图24
• 2.2 实验方法24-29
• 2.2.1 纤维质水解菌群的富集筛选24
• 2.2.2 水解菌群的分解性能稳定性实验24-25
• 2.2.3 PCR-DGGE 技术分析菌群结构稳定性及其优势微生物的初步鉴定25-26
• 2.2.4 纤维质水解菌群的复合酶系表达及其关键水解酶的酶学特性分析26-27
• 2.2.5 纤维质水解菌群分解木薯渣的发酵特性分析27
• 2.2.6 培养基及其培养条件对菌群水解性能的影响27-28
• 2.2.7 高温厌氧ASBR 反应器处理木薯酒糟废液的启动和运行28
• 2.2.8 纤维质分解菌群和高温厌氧出水循环的耦合对木薯酒糟水解产甲烷的影响28-29
• 2.3 实验主要分析项目及测定方法29-32
• 2.3.1 底物失重率和底物分解速率29
• 2.3.2 pH 和ORP 的测定29
• 2.3.3 生物量的测定29
• 2.3.4 木薯渣成分分析29
• 2.3.5 COD 和sCOD 的测定29-30
• 2.3.6 总糖的测定30
• 2.3.7 总VFA 的测定30
• 2.3.8 酶活力的测定30
• 2.3.9 氨氮、总N 和凯氏氮的测定30
• 2.3.10 甲烷体积的测定30
• 2.3.11 小分子代谢产物的测定30
• 2.3.12 碱度的测定30-32
• 第三章 结果与讨论32-69
• 3.1 纤维质水解功能菌群的构建、稳定性分析及其初步鉴定32-38
• 3.1.1 纤维质水解菌群的构建结果32-33
• 3.1.2 水解菌群RXS 的分解性能稳定性33-35
• 3.1.3 PCR-DGGE 技术分析菌群的结构稳定性及其优势微生物的初步鉴定35-37
• 3.1.4 小结37-38
• 3.2 纤维质水解菌群RXS 的复合酶系表达及其关键水解酶的酶学特性分析38-42
• 3.2.1 菌群RXS 的胞外水解酶分泌表达状况38-39
• 3.2.2 粗酶液中关键水解酶的最适反应温度及其温度稳定性研究39-40
• 3.2.3 粗酶液中关键水解酶最适反应pH 及其pH 稳定性研究40-41
• 3.2.4 酶促反应时间对酶活力的影响41
• 3.2.5 金属离子、表面活性剂及其螯合剂对酶活力的影响41-42
• 3.2.6 小结42
• 3.3 纤维质水解菌群RXS 分解木薯渣的发酵特性分析42-48
• 3.3.1 pH、ORP 和生物量的变化42-44
• 3.3.2 关键水解酶活力的变化44
• 3.3.3 复合菌群对木薯渣降解效果的影响44-46
• 3.3.4 复合菌群分解木薯渣过程中C 源和N 源物质的变化分析46
• 3.3.5 复合菌群分解木薯渣过程中水解液中可溶性物质分析46-47
• 3.3.6 小结47-48
• 3.4 培养基及其培养条件对菌群RXS 水解纤维质底物效果的影响48-55
• 3.4.1 菌群对不同纤维质底物分解效果的比较48-49
• 3.4.2 碳源添加量对复合菌群发酵性能的影响49
• 3.4.3 氮源种类对复合菌群发酵性能的影响49-50
• 3.4.4 培养温度对复合菌群水解木薯渣的影响50-51
• 3.4.5 接种体积分数对菌群水解效果的影响51-52
• 3.4.6 初始pH 对复合菌群水解木薯渣的影响52-53
• 3.4.7 转速对复合菌群水解木薯渣的影响53-55
• 3.4.8 小结55
• 3.5 纤维质分解菌群RXS 强化木薯酒糟水解产甲烷过程的研究55-60
• 3.5.1 水解过程中通气量的确定55-56
• 3.5.2 高温厌氧出水回流比的确定56-57
• 3.5.3 木薯酒糟水解过程中胞外水解酶的分泌57
• 3.5.4 木薯酒糟水解过程中水解液特性分析57-59
• 3.5.5 不同水解时间下甲烷产生状况的变化59
• 3.5.6 小结59-60
• 3.6 不同OLR 的木薯酒糟单相和两相甲烷发酵的对比分析60-65
• 3.6.1 甲烷发酵出水特性对比分析60-61
• 3.6.2 厌氧出水中sCOD、总糖和VFA 的变化61-62
• 3.6.3 厌氧出水中总氮和氨氮浓度的分析62-63
• 3.6.4 不同OLR 的酒糟单相和两相甲烷发酵时日产气量的对比分析63-64
• 3.6.5 比产甲烷速率分析64-65
• 3.6.6 小结65
• 3.7 讨论65-69
• 3.7.1 纤维质分解复合菌群和纤维质资源的利用65-66
• 3.7.2 两相分离提高纤维质废弃物甲烷化的分析66
• 3.7.3 “微好氧水解”降低回用水中酒精发酵抑制物质的有效性66-69
• 主要结论与展望69-72
• 主要结论69-70
• 展望70-72
• 致谢72-73
• 参考文献73-79
• 附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文79

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