甲烷氧化菌素检测、生物合成及结构表征

【摘要】：甲烷氧化菌和甲烷单加氧酶作为重要的多功能微生物催化剂,应用潜力巨大,受到众多研究机构的关注。甲烷氧化菌素(mb)是甲烷氧化菌分泌的一种捕获Cu的小分子肽。目前国际上对mb的研究刚刚起步,但由于还没有分离纯化出高纯度的mb,因此对于mb还没有一个通用检测其含量的方法；另外,不同甲烷氧化菌所产生的mb的结构和组成也会有一定的差别,本论文主要研究了mb的检测方法建立、发酵合成及Methylosinus trichosporium3011菌种分泌的mb的初步结构特征。本实验的研究内容包括： 根据mb具有的铜结合特性,建立了一个液态快速检测mb含量的方法,最适体系为chrome azurol S(CAS)、Cu2+、助色剂、缓冲溶液的添加量分别为2mL、1mL、4mL和0.5mL,反应时间为15min,利用紫外-可见分光光度计,在605nm波长下检测mb的含量。该方法具有操作简单、快速准确、实用性强等特点,为mb发酵生产的研究提供依据。 采用CAS劈半平板法研究发现Methylosinus trichosporium3011(IMV3011)、 Methylosinus trichosporium OB3b(OB3b)、Methylococcus capsulatus3021(IMV3021)、 Methylomonas sp.GYJ3(GYJ3)这四种菌在使用nitrate mineral salt(NMS)培养基的情况下分泌mb的量相差不大,在一定量的Cu2+的培养基中,采用甲醇做为碳源时,菌种的生长速度加快,mb的分泌量也较甲烷做碳源时的大。 以甲烷、甲醇分别作为碳源液态培养IMV3011时发现,在Cu2+的浓度由0μM渐变到1.5μM的过程中,Cu2+浓度为0μM时,二者的单位细胞产mb的量最大。将甲烷与甲醇作碳源的培养结果进行比较后发现,Cu2+浓度为0μM时,甲烷培养液中的mb含量高于甲醇培养液的；而在Cu2+浓度达到1.5μM时,甲醇培养中的mb分泌的总量却高于甲烷培养的。Cu2+浓度从0μM增加到1.5μM的过程中,甲烷培养液中的mb产量变化量大于甲醇培养的。 由IMV3011菌株获得的mb能够促进包括其在内的4种甲烷氧化菌的颗粒性甲烷单加氧酶(pMMO)表达,表明不同的甲烷氧化菌同样能够吸收来自于IMV3011的mb捕获的铜,据此认为mb可能不具有菌属专一性。 采用固相萃取技术纯化mb,结果表明,mb的固相萃取法的条件为洗脱液为60%乙腈水溶液,样品流速为2mL/min,上样量上限为200mL 采用液质联用仪、荧光光谱和紫外吸收光谱对mb的分子结构进行推测,结果表明,IMV3011菌分泌的mb分子量可能为846.1441,推测其分子式为C30H38N8O13S4 【关键词】：甲烷氧化菌素 分泌能力 甲炕氧化菌 分离纯化
【学位授予单位】：哈尔滨商业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：Q93
【目录】：

• 摘要5-6
• Abstract6-11
• 1 绪论11-20
• 1.1 甲烷11
• 1.2 甲烷氧化菌11-15
• 1.2.1 甲烷单加氧酶13-15
• 1.3 甲烷氧化菌素15-17
• 1.3.1 甲烷氧化菌素的发现15-16
• 1.3.2 甲烷氧化菌素的结构16-17
• 1.4 本课题来源及研究的意义17-18
• 1.4.1 课题来源17
• 1.4.2 甲烷氧化菌素的研究意义17-18
• 1.5 论文的研究内容18-20
• 2 甲烷氧化菌素的检测20-34
• 2.1 引言20
• 2.2 实验仪器与材料20-22
• 2.2.1 实验仪器20
• 2.2.2 实验材料20-22
• 2.3 实验方法22-25
• 2.3.1 CAS分光光度法的建立22-24
• 2.3.2 劈半平板法检测甲烷氧化菌素24-25
• 2.4 结果与分析25-32
• 2.4.1 吸收光谱的测定结果与分析25-27
• 2.4.2 甲烷氧化菌素线性关系确定结果27
• 2.4.3 CuSO_4添加量的测定结果27-28
• 2.4.4 络合时间的测定结果28
• 2.4.5 助色剂HDTMA体积测定结果28-29
• 2.4.6 缓冲体系用量的选择29
• 2.4.7 共存离子的影响29-30
• 2.4.8 工作曲线测定结果30
• 2.4.9 样品分析结果30-31
• 2.4.10 不同甲烷氧化菌在以甲烷为碳源情况下产mb的比较31-32
• 2.4.11 甲烷氧化菌在不同碳源培养下分泌mb的比较32
• 2.5 本章小结32-34
• 3 铜离子浓度、碳源对甲烷氧化菌素产量的影响34-43
• 3.1 引言34
• 3.2 实验仪器与材料34-35
• 3.2.1 实验仪器34-35
• 3.2.2 实验材料35
• 3.3 实验方法35-38
• 3.3.1 甲烷氧化菌的培养35-36
• 3.3.2 大孔树脂法纯化甲烷氧化菌素36
• 3.3.3 MMO活性测定方法36
• 3.3.4 甲烷为碳源下Cu~(2+)对IMV 3011生长及发酵的影响36-37
• 3.3.5 甲醇为碳源下Cu~(2+)对IMV 3011生长及发酵的影响37
• 3.3.6 甲烷氧化菌素种属专一性研究37-38
• 3.4 结果与分析38-42
• 3.4.1 气相色谱测定环氧丙烷标准曲线测定38-39
• 3.4.2 甲烷为碳源下Cu~(2+)对IMV 3011生长及发酵的影响39-40
• 3.4.3 甲醇为碳源下Cu~(2+)对IMV 3011生长及发酵的影响40
• 3.4.4 甲烷氧化菌素种属专一性研究40-42
• 3.5 本章小结42-43
• 4 甲烷氧化菌素的纯化、结构表征研究43-52
• 4.1 引言43
• 4.2 实验仪器与材料43-44
• 4.2.1 实验仪器43-44
• 4.2.2 实验材料44
• 4.3 实验方法44-46
• 4.3.1 固相萃取法纯化甲烷氧化菌素44-45
• 4.3.2 IMV 3011甲烷氧化菌素干粉液质、荧光光谱、紫外的分析45-46
• 4.4 结果与分析46-51
• 4.4.1 固相萃取洗脱体系的确定46
• 4.4.2 固相萃取洗脱梯度的确定46-47
• 4.4.3 固相萃取处理量的确定47
• 4.4.4 固相萃取上样速度的确定47
• 4.4.5 IMV 3011甲烷氧化菌素结构表征47-51
• 4.5 本章小结51-52
• 结论52-54
• 参考文献54-58
• 攻读学位期间发表的学术论文58-59
• 致谢59

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