内酯水解酶重组罗伊氏乳杆菌可有效降解玉米赤霉烯酮毒素

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文章背景简介

BACKGROUND INTRODUCTION

真菌毒素是丝状真菌产生的次级代谢产物，可在田间以及收获、运输、加工或储存期间污染农作物。联合国粮农组织（粮农组织）估计，世界上25％的以作物为基础的农产品会受到真菌毒素污染，导致全球每年大约损失1亿吨粮食。玉米赤霉烯酮（ZEN）是镰刀菌真菌产生的一种类雌激素真菌毒素，是食品和饲料中最常见的真菌毒素之一。ZEN可以激活雌激素受体，会导致农场动物的生殖障碍，偶尔也会导致人类出现高雌激素综合征。因此，ZEN不仅会造成牲畜生产效率较低而引起重大经济损失，而且会对食用受ZEN污染食物的人构成健康风险。减少ZEN健康风险的理想解决方案是避免食品和饲料中的ZEN污染。然而，这在目前的农业实践却难以做到。因此，对已经被ZEN污染的农产品进行解毒处理是另一种不错的选择。食品和饲料中ZEN的去除方法包括化学方法，如将含有ZEN的食品暴露于臭氧或过氧化氢中；物理方法，如挤压加工；生物方法，如使用生物转化剂将ZEN降解为无毒代谢产物或使用吸附剂降低其生物利用度。 在这些ZEN解毒方法中，生物方法更为可取，因为生物法可以在温和条件下去除真菌毒素，不必使用有害化学物质，也不会造成食品和饲料营养价值和适口性的重大损失。

zhd101是一种由Clonostachys rosea菌产生的内酯酶，它能将ZEN转化为酮类物质，这是一种毒性明显较低的产品。在以前的研究中，zhd101已在大肠杆菌、酿酒酵母和水稻植株中成功表达，由这些转基因生物产生的重组zhd101可有效降解ZEN。

益生菌一直被用作饲料添加剂，因为它们有使肠道微生物群正常化，增强免疫系统，预防腹泻，提高饲料转化效率等功能。虽然益生菌发挥了许多有益的作用，但有人推测，它们的特性可以通过遗传修饰得到进一步改善。罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri）是动物肠道菌群中常见的潜在益生菌之一。Lactobacillus reuteri Pg4最初是从健康肉鸡的胃肠道中分离出来的，已被证明能够耐受酸、盐和胆汁，抑制病原体生长，并能粘附粘蛋白和粘液。此外，Lactobacillus reuteri Pg4已被用于异源表达一些纤维分解酶，包括β－葡聚糖酶、木聚糖酶和纤维素酶等。重组Lactobacillus reuteri Pg4菌株已被证明能够在不损失其益生菌特性的情况下分解纤维。

2017年4月24日，台湾大学生物技术研究所Wen？Chun Yang等人在《Microbial Cell Factories》杂志（IF2017＝3．831，生物工程与应用微生物2区）上发表了题为“expression of the Clonostachys rosea lactonohydrolase gene by Lactobacillus reuteri to increase its zearalenone－removing ability”的文章。在该研究中，作者介绍了zhd101基因在Lactobacillus reuteri Pg4中的异源表达，并检测了重组菌中异源酶的产生、酸和胆盐耐受性以及粘附能力。

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所用到的主要方法

METHODS

1、反转录聚合链式反应－RT－PCR

2、蛋白质印记分析－WB

3、高效液相色谱－HPLC

4、耐酸耐胆盐

5、细胞粘附性实验

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文章主要内容摘要

ABSTRACT

在以前的研究中，本实验室诱导Lactobacillus reuteri Pg4表达纤维溶解酶，发现转化的Lactobacillus reuteri菌株获得了分解植物纤维的能力，从而导致肉鸡体重增加、饲料转化效率提高。本研究将zhd101基因导入到Lactobacillus reuteri Pg4中，转化菌株Lactobacillus reuteri pNZ－zhd101成功表达了zhd101，获得了降解ZEN的能力。据我们所知，这是第一次报告成功表达ZEN降解酶的肠道乳酸杆菌。

在含有4．5 mg／L ZEN的MRS肉汤中培养3株Lactobacillus reuteri 14小时后，发现Lactobacillus reuteri pNZ－zhd101肉汤中的ZEN浓度下降了99．3％。Takahashi－Ando等人发现从大肠杆菌表达系统获得的重组zhd101在低于4．5的pH值下会发生不可逆地失活。为此，本实验在发酵过程中将Lactobacillus reuteri pNZ－zhd101培养基的pH值维持在7．0，发现Lactobacillus reuteri pNZ－zhd101在这种培养条件下可以有效地去除ZEN。这些结果表明：由Lactobacillus reuteri pNZ－zhd101产生的重组zhd101在pH7．0下呈活性形式。通常而言，猪小肠、盲肠和结肠的平均ph值分别为6．5、6．1和6．5，鸡的作物、小肠、盲肠和结肠的平均ph值分别为6．1、6．4、6．4和6．6。由于这些动物肠道环境均呈弱酸性至中性，研究者认为Lactobacillus reuteri pNZ－zhd101产生的重组zhd101可以以活性形式直接输送到肠道。

在之前的一项研究中，我们观察到Lactobacillus reuteri Pg4在体外对酸性条件和胆汁盐接触具有抵抗力。在本研究中，所有三株Lactobacillus reuteri Pg4菌株在pH3．0下培养4小时后或在含有0．5％牛胆的MRS肉汤中培养24小时后均存活。此外，在酸性条件下或胆汁盐存在下，Lactobacillus reuteri 转化菌株的细菌计数与Lactobacillus reuteri Pg4的细菌计数没有差异。这些结果表明：Lactobacillus reuteri Pg4菌株可以通过胃运输存活下来，并可能在肠道环境中存活，在那里它们可以有效工作。

Caco－2细胞系已广泛用于益生菌体外黏附能力的评价。在这项研究中，将荧光标记的Lactobacillus reuteri pNZ－zhd101与Caco－2细胞孵育2h后，分析显示Lactobacillus reuteri 细胞能粘附在Caco－2细胞上，而目前已证实益生菌可以与致病细菌竞争肠道上皮细胞上相同的结合位点。此外，重组益生菌分泌的特异性酶附着在小肠上皮细胞上，可直接作用于小肠消化道中的底物，在小肠消化道中可吸收大部分ZEN。因此，Lactobacillus reuteri pNZ－zhd101粘附肠道粘膜细胞的能力延长了其在肠道中的停留时间，从而使其达到最大益生菌效果。

总的来说，本实验成功地在Lactobacillus reuteri 菌株中克隆了水解酶基因zhd101，并检测确证该异源zhd101可在转化株Lactobacillus reuteri pNZ－zhd101中实现功能性的表达。异源蛋白zhd101的产生并不影响菌株的生长、耐酸耐胆盐性，对Lactobacillus reuteri pNZ－zhd101的粘附能力影响较小。因此，我们认为Lactobacillus reuteri pNZ－zhd101有可能作为益生菌饲料添加剂用于ZEN的降解。

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